TY - JOUR A1 - Ali, Aamir A1 - Khan, Muhammad Moman A1 - Kolenda, Rafal A1 - Olowe, Olugbenga Adekunie A1 - Weinreich, Jörg A1 - Li, Ganwu A1 - Schierack, Peter T1 - The role of AJB35136 and fdtA genes in biofilm formation by avian pathogenic Escherichia coli T1 - Die Rolle von AJB35136- und fdtA-Genen bei der Biofilmbildung von aviären pathogenen Escherichia coli N2 - Background Infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC) result in significant economic losses in poultry industry. APEC strains are known to form biofilms in various conditions allowing them to thrive even under harsh and nutrient-deficient conditions on different surfaces, and this ability enables them to evade chemical and biological eradication methods. Despite knowing the whole genome sequences of various APEC isolates, little has been reported regarding their biofilm-associated genes. A random transposon mutant library of the wild-type APEC IMT 5155 comprising 1,300 mutants was analyzed for biofilm formation under nutrient deprived conditions using Videoscan technology coupled with fluorescence microscopy. Seven transposon mutants were found to have reproducibly and significantly altered biofilm formation and their mutated genes were identified by arbitrary PCR and DNA sequencing. The intact genes were acquired from the wild-type strain, cloned in pACYC177 plasmid and transformed into the respective altered biofilm forming transposon mutants, and the biofilm formation was checked in comparison to the wild type and mutant strains under the same conditions. Results In this study, we report seven genes i.e., nhaA, fdeC, yjhB, lysU, ecpR, AJB35136 and fdtA of APEC with significant contribution to biofilm formation. Reintroduction of AJB35136 and fdtA, reversed the altered phenotype proving that a significant role being played by these two O-antigen related genes in APEC biofilm formation. Presence of these seven genes across nonpathogenic E. coli and APEC genomes was also analyzed showing that they are more prevalent in the latter. N2 - Hintergrund Infektionen, die durch aviäre pathogene Escherichia coli (APEC) verursacht werden, führen zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Geflügelindustrie. Es ist bekannt, dass APEC-Stämme unter verschiedenen Bedingungen Biofilme bilden, die es ihnen ermöglichen, selbst unter rauen und nährstoffarmen Bedingungen auf verschiedenen Oberflächen zu gedeihen. Diese Fähigkeit ermöglicht es ihnen, sich chemischen und biologischen Eradikationsmethoden zu entziehen. Obwohl die gesamten Genomsequenzen verschiedener APEC-Isolate bekannt sind, wurde bisher nur wenig über ihre Biofilm-assoziierten Gene berichtet. Eine zufällige Transposon-Mutantenbibliothek des Wildtyps APEC IMT 5155, die 1.300 Mutanten umfasst, wurde mit Hilfe der Videoscan-Technologie in Verbindung mit Fluoreszenzmikroskopie auf Biofilmbildung unter nährstoffarmen Bedingungen untersucht. Bei sieben Transposon-Mutanten wurde eine reproduzierbare und signifikant veränderte Biofilmbildung festgestellt, und ihre mutierten Gene wurden durch willkürliche PCR und DNA-Sequenzierung identifiziert. Die intakten Gene wurden dem Wildtyp-Stamm entnommen, in das pACYC177-Plasmid kloniert und in die jeweiligen veränderten biofilmbildenden Transposon-Mutanten transformiert, und die Biofilmbildung wurde im Vergleich zum Wildtyp und den mutierten Stämmen unter denselben Bedingungen überprüft. Ergebnisse In dieser Studie konnten wir sieben Gene, d.h. nhaA, fdeC, yjhB, lysU, ecpR, AJB35136 und fdtA von APEC mit einem signifikanten Beitrag zur Biofilmbildung nachweisen. Die Wiedereinführung von AJB35136 und fdtA kehrte den veränderten Phänotyp um, was beweist, dass diese beiden mit dem O-Antigen verbundenen Gene eine wichtige Rolle spielen. KW - APEC KW - Biofilm KW - Gene KW - Complementation KW - Transposon mutant KW - VideoScan KW - Genkomplementierung KW - Transposon-Mutanten KW - Geflügelkrankheit KW - Escherichia coli KW - Biofilm KW - Komplementation KW - Transponson KW - Mutant Y1 - 2023 U6 - https://doi.org/10.1186/s12917-023-03672-7 ER - TY - THES A1 - Khan, Muhammad Moman T1 - Escherichia coli colonization T1 - Kolonisierung mit Escherichia coli N2 - To increase our understanding of bacterial intestinal colonization in animal populations lacking anthropogenic influence we devised the first objective and studied the diversity of E. coli in pristine wild animal population. Overall, E. coli in cormorants maintained a high diversity under minimal anthropogenic influences. E. coli were isolated from individual birds of two cormorant colonies located on small islands in lakes at least 100 km away from human settlements. Diversity of the isolates was studied using pulsed field gel electrophoresis (PFGE). 137 isolates of cormorant colony-1 and 75 isolates of cormorant colony-2 resulted in 60 and 33 PFGE types, respectively. Representative strains of each PFGE type were analysed in terms of phylogroups, extraintestinal virulence associated genes (exVAGs), adhesion to the chicken intestinal cell line and antimicrobials. Most isolates belonged to phylogroup B1 (68.3%) followed by B2 and E with B2 harbouring the highest total number of exVAGs per isolate. Surprisingly, a PFGE type with relatively few exVAGs displayed the highest isolation frequency, also showing a high adhesion rate. Comparative analysis of exVAGs to other E. coli populations of wildlife origin revealed that the secreted autotransporter toxin encoding sat gene was only present in cormorants. The second objective was to characterize and identify factors contributing to the novel adhesion phenotype, known as Clumpy adhesion by the strain 4972 E. coli when incubated on human urinary bladder 5637 cell line. Transcriptome and proteome of adhered bacteria clustered together and diverged from bacteria in the supernatant. The clumpy structure was further explored in terms antibiotic stress where sessile structures could tolerate high antibiotic pressure of ampicillin up to 16 mg/ml and gentamicin up to 2 µg/ml. Data analysis unveiled differential expression of 623 genes between bacteria forming clumps and in supernatant. 148 genes were hypothetical and five hypothetical genes i.e., ffp, espX1, pilV, spnT and yggT along with four known genes i.e., dnaK, spy, flgH and fimH were targeted for deletion. Seven genes deletion mutants, three known (i.e., spy, flgH and fimH) and four hypothetical (ffp, pilV, spnT and yggT) genes were successfully generated and analysed for various parameters. ΔflgH showed loss of clumpy phenotype and adhesion ability up to 80% was regenerated by complementation. When antibiotic stress by ampicillin was applied after clump formation, Δffp depicted no effect of high concentration of ampicillin. In case of ΔpilV, adhesion significantly increased to 151% and upon complementation, adhesion was reduced to 53%. ΔspnT during ampicillin stressed adhesion fared almost 8.5 times better than the wild type strain. ΔyggT exhibited high adhesion of 145.5 % and upon reintroduction, adhesion decreased to 13%. Overall, we were able characterize a new phenotype and determined the role of genes contributing to clumpy adhesion phenotype. N2 - Um das Verständnis von der bakteriellen Darmbesiedlung in Tierpopulationen ohne anthropogene Einflüssne zu verbessern, wurde die Vielfalt von E. coli in unberührten Wildtierpopulationen untersucht. Die Diversität von E. coli in Kormoranen unter minimalen anthropogenen Einflüssen ist hoch. E. coli wurden von einzelnen Komoranen aus zwei Kolonien isoliert, die sich auf kleinen Inseln in Seen befinden (>100 km von menschlichen Siedlungen entfernt). Die Diversität der Isolate wurde mittels Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) untersucht. 137 Isolate von Kolonie-1 und 75 Isolate von Kolonie-2 ergaben 60 bzw. 33 PFGE-Typen. Repräsentative Stämme jedes PFGE-Typs wurden hinsichtlich Phylogruppen, extraintestinale Virulenz-assoziierte Gene (exVAGs), Adhäsion an einer Hühnerdarmzelllinie und Antibiotikaresistenzen analysiert. Die meisten Isolate gehörten zur Phylogruppe B1 (68,3 %), gefolgt von B2 und E, wobei B2 die höchste Gesamtzahl an exVAGs pro Isolat aufwies. Überraschenderweise wies ein PFGE-Typ mit relativ wenigen exVAGs die höchste Isolationshäufigkeit auf und zeigte eine hohe Adhäsionsrate. Eine vergleichende Analyse der exVAGs mit anderen E. coli - Populationen aus Wildtieren ergab, dass das sat-Gen (sekretierte Autotransporter-Toxin) nur bei Kormoranen vorkommt. Das 2. Ziel war die Charakterisierung und Identifizierung von Faktoren, die zu einem neuartigen Adhäsionsphänotyp beitragen; wird E. coli-Stamm 4972 auf der Zelllinie 5637 inkubiert, adhäriert dieser in Klumpen. Transkriptom und Proteom der anhaftenden Bakterien gruppierten sich zusammen und unterschieden sich von den Bakterien im Überstand. Die klumpige Struktur wurde auf Antibiotikastress untersucht, wobei die sessilen Strukturen einen hohen Antibiotikadruck tolerierten (bis zu 16 mg/ml Ampicillin und bis zu 2 µg/ml Gentamicin). Die Datenanalyse ergab eine unterschiedliche Expression von 623 Genen zwischen Bakterien, die Klumpen bilden, und solchen im Überstand. 148 Gene waren hypothetisch. Fünf hypothetische Gene (ffp, espX1, pilV, spnT, yggT) sowie vier bekannte Gene (dnaK, spy, flgH, fimH) wurden gezielt deletiert. Sieben Gen-Deletionsmutanten (spy, flgH, fimH und ffp, pilV, spnT, yggT) wurden erfolgreich erzeugt und auf verschiedene Parameter untersucht. ΔflgH zeigte einen Verlust des klumpigen Phänotyps und die Adhäsionsfähigkeit wurde durch Komplementierung zu 80 % wiederhergestellt. Wurde nach der Klumpenbildung eine antibiotische Belastung mit Ampicillin durchgeführt, zeigte Δffp keine Wirkung bei hohen Konzentration. Bei ΔpilV erhöhte sich die Adhäsion signifikant auf 151 %, und nach der Komplementierung betrug die Adhäsion 53 %. ΔspnT schnitt bei Ampicillin-belasteter Adhäsion fast 8,5 Mal besser ab als der Wildtyp-Stamm. ΔyggT wies eine hohe Adhäsion von 145,5 % auf, und sank nach Wiedereinführung auf 13 %. Insgesamt konnten wir einen neuen Phänotyp charakterisieren und die Rolle von Genen bestimmen, die zum Phänotyp der klumpigen Adhäsion beitragen. KW - E. coli KW - Colonization KW - Adhesion KW - Antibiotic resistance KW - Genes KW - Kolonisation KW - Antibiotikaresistenz KW - Gene KW - Adhäsion KW - Tiere KW - Darmflora KW - Escherichia coli KW - Gen KW - Antibiotikum KW - Arzneimittelreistenz Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-64429 ER -