TY - JOUR A1 - Liedtke, Victoria A1 - Weiss, Romano A1 - Skifov, Anastasia A1 - Rödiger, Stefan A1 - Schenk, Lysann T1 - Fully automated viability and toxicity screening : a reliable all-in-one attempt T1 - Vollautomatisches Vitalitäts- und Toxizitätsscreening : ein zuverlässiger all-in-one Ansatz JF - Cancer Medicine N2 - The CRISPR/Cas9 technology is nowadays a common tool for genome editing to achieve new insights into, e.g., diagnostics and therapeutics in cancer and genetic disorders. Cell proliferation and anti-cancer drug response studies are widely used to evaluate the impact of editing. However, these assays are often time-consuming, expensive and reproducibility is an issue. To overcome this, we developed a fast and cheap assay that combines a fully automated multispectral fluorescence microscopy platform with a nuclei staining and open source software analysis. Here, we generated different LEDGF/p75 model cell lines to validate the effect on proliferation and chemosensitivity. Therefore, a fast protocol for an optimized all-in-one attempt for cytotoxicity screenings and proliferation analysis of adherent cells in a 96-well plate format was established using differential staining with two fluorescent dyes (Hoechst 33342 and propidium iodide) for live/dead cell discrimination. Subsequently, an automated cell nuclei count and analysis was performed using bioimage informatics. With the new established assay technology, up to 50000 cells/well can be detected and analyzed in a 96-well plate, resulting in a fast and accurate verification of viability and proliferation with consistency of 98 % compared to manual counting. Our screening revealed that LEDGF depletion using CRISPR/Cas9 showed a diminished proliferation and chemosensitivity independent of cell line origin. Moreover, LEDGF depletion caused a significant increase in 𝛾H2AX foci, indicating a substantial increase in DNA double strand breaks. LEDGF/p75 overexpression enhanced proliferation and chemoresistance underlining the role of LEDGF in DNA damage response. Independent of cancer cell type, LEDGF/p75 is a central player in DNA damage repair and is implicated in chemoresistance. Moreover, our automated fluorescence biosensor technology allowed fast and reliable data acquisition without any fixation or additional washing steps. Additionally, data analysis was implemented using modular open source software that can be adapted as needed. N2 - Die CRISPR/Cas9-Technologie ist heute ein gängiges Werkzeug für die Genom-Editierung, um neue Erkenntnisse für z. B. die Diagnostik und Therapie von Krebserkrankungen und genetischen Störungen zu gewinnen Studien zur Zellproliferation und zum Ansprechen auf Krebsmedikamente werden häufig eingesetzt, um die Auswirkungen des Editierens zu bewerten. Diese Tests sind jedoch oft zeitaufwändig, teuer und in der Reproduzierbarkeit ungenau. Um dies zu überwinden, haben wir einen schnellen und kostengünstigen Test entwickelt, der eine vollautomatische multispektrale Fluoreszenzmikroskopie-Plattform mit einer Kernfärbung und einer Open-Source-Software-Analyse kombiniert.Wir haben verschiedene LEDGF/p75-Modellzelllinien generiert, um die Auswirkungen auf die Proliferation und Chemosensitivität zu validieren. Daher wurde ein schnelles Protokoll für einen optimierten All-in-One-Ansatz für Zytotoxizitäts-Screenings und Proliferationsanalysen von adhärenten Zellen in einem 96-Well-Plattenformat erstellt, bei dem eine differenzierte Färbung mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (Hoechst 33342 und Propidiumjodid) zur Unterscheidung von lebenden und toten Zellen verwendet wurde. Anschließend wurde eine automatische Zählung und Analyse der Zellkerne mit Hilfe der Bioimage-Informatik durchgeführt. Mit der neuen etablierten Assay-Technologie können bis zu 50.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte nachgewiesen und analysiert werden, was eine schnelle und genaue Überprüfung der Lebensfähigkeit und Proliferation mit einer Übereinstimmung von 98 % im Vergleich zur manuellen Zählung ermöglicht. Unser Screening ergab, dass die Deletion von LEDGF mit CRISPR/Cas9 eine verringerte Proliferation und Chemosensitivität, unabhängig von der Herkunft der Zelllinie, zur Folge hatte. Darüber hinaus führte die Deletion von LEDGF zu einer signifikanten Zunahme von 𝛾H2AX-Foci, was auf eine erhebliche Zunahme von DNA-Doppelstrangbrüchen hinweist. Die Überexpression von LEDGF/p75 erhöhte die Proliferation und Chemoresistenz, was die Rolle von LEDGF bei der DNA-Schadensreaktion unterstreicht. Unabhängig vom Krebszelltyp ist LEDGF/p75 ein zentraler Akteur bei der DNA-Schadensreparatur und ist an der Chemoresistenz beteiligt. Darüber hinaus ermöglichte unsere automatisierte Fluoreszenz-Biosensor-Technologie eine schnelle und zuverlässige Datenerfassung ohne Fixierung oder zusätzliche Waschschritte. Darüber hinaus wurde die Datenanalyse mit einer modularen Open-Source-Software durchgeführt, die je nach Bedarf angepasst werden kann. KW - Automated system KW - CRISPR/Cas9 KW - Bioimage informatics KW - Viability KW - Cytotoxicity KW - Automatisiertes System KW - Vitalität KW - Bioimage-Informatik KW - Zytotoxizität KW - Multiparameteranalyse KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Cytotoxizität KW - Proliferation KW - Vitalität Y1 - 2023 U6 - https://doi.org/10.1002/cam4.7392 SN - 2045-7634 VL - 13 IS - 12 PB - Wiley CY - Weinheim ER - TY - THES A1 - Liedtke, Victoria T1 - Lens epithelium-derived growth factor (LEDGF) as an aid in the diagnosis of benign prostatic hyperplasia (BPH) and the molecular principles of LEDGF in human cancer cells T1 - Vom Linsenepithel abgeleiteter Wachstumsfaktor (LEDGF) als Hilfsmittel für die Diagnose der gutartigen Prostatahyperplasie (BPH) und die molekularen Grundlagen von LEDGF in menschlichen Krebszellen N2 - Benign prostatic hyperplasia (BPH) is considered an age-related disease of men with unknown etiopathophysiology. Chronic inflammation represents one of the most important pathophysiological mechanisms in this context, and there is also evidence for the involvement of autoimmune responses in an inflammatory environment in the prostate. Conventional therapeutic approaches for BPH are limited; however, immunosuppression by TNF (tumor necrosis factor)-𝛼 blockers seems to reduce symptoms in BPH patients due to the reduction of epithelial hyperplasia and macrophage-triggered inflammation. Therefore, this cumulative dissertation addresses biomarker-based BPH diagnosis by lens epithelium-derived growth factor splice variant 75 kDa (LEDGF/p75). LEDGF/p75 is an autoantigen that is overexpressed in solid tumors and functions as a stress-related transcriptional co-activator. It also plays an important role in cancer and DNA damage repair (DDR). The generation of CRISPR/Cas9-modified HEp-2 LEDGF deficient (KO) and HEp-2 LEDGF/p75 overexpressing (OE) cell lines provided new insights for the diagnosis and therapy of cancer and genetic disorders. Herein, IgG autoantibody reactivity to LEDGF/p75 was detected in patients with prostate cancer (PCa, n=89), bladder cancer (BCa, n=116), benign prostatic hyperplasia (BPH, n=103) and blood donors (BD, n=60) by indirect immunofluorescence assay (IFA) linear immunoassay (LIA) and Chritidia luciliae immunofluorescence test (CLIFT). In addition, proliferation and migration capacity as well as chemosensitivity of genome-edited cells were determined by optimized all-in-one approach, followed by investigation of DDR signaling pathways by Western blot and immunofluorescence. Surprisingly, no increased binding of autoantibodies (autoAbs) to LEDGF/p75 was detected in cancer patients, but autoAb reactivity to LEDGF/p75 O/E cells was unexpectedly increased in approximately 50% of patients with BPH. At the molecular level, LEDGF-deficient cells exhibit decreased proliferation and migration and increased sensitivity to the chemotherapeutic agent etoposide. A significantly Decreased DNA damage response could also be visualized. New diagnostic capabilities using HEp-2 cells overexpressing LEDGF/p75 or mitochondrial DNA as autoimmune targets could be used to identify BPH patients with autoimmune responses. Furthermore, this Thesis shows that LEDGF is not only involved in the recruitment of DNA damage response proteins, but also affects the proteosomal regulation of DDR signaling molecules. N2 - Die benigne Prostatahyperplasie (BPH) gilt als altersbedingte Erkrankung des Mannes mit unbekannter Etiopathophysiology. Chronische Entzündungen stellen in diesem Zusammenhang eine der wichtigsten pathophysiologischen Mechanismen dar, zudem gibt es Beweise für die Beteiligung von Autoimmunreaktionen in einem entzündlichen Umfeld in der Prostata. Konventionelle Therapiekonzepte für BPH sind begrenzt, eine Immunsuppression durch TNF-𝛼-Blocker scheint jedoch die Symptome bei BPH-Patienten aufgrund der Verringerung der Epithelhyperplasie und der durch Makrophagen ausgelösten Entzündung zu verringern. Die vorliegende kumulative Dissertation befasst sich daher mit der Biomarker-basierten BPH-Diagnostik durch die vom Linsenepithel-abgeleitete Wachstumsfaktor Splicevariante mit 75 kDa (LEDGF/p75). LEDGF/p75 ist ein Autoantigen, das in soliden Tumoren überexprimiert wird und als stressbedingter transkriptioneller Co-Aktivator fungiert. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei Krebs und der DNA-Schadensreparatur. Durch die Erzeugung von CRISPR/Cas9-modifizierten HEp-2 LEDGF defizienten und HEp-2 LEDGF/p75 überexprimierenden Zelllinien konnten neue Erkenntnisse für die Diagnostik und Therapie von Krebs und genetischen Störungen gewonnen werden. Hierfür wurde die IgG-Autoantikörperreaktivität auf LEDGF/p75 bei Patienten mit Prostatakrebs (PCa, n=89), Blasenkrebs (BCa, n=116), benigner Prostatahyperplasie (BPH, n=103) und Blutspendern (BD, n=60) mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IFA) linearem Immunoassay (LIA) und Chritidia luciliae Immunfluoreszenztest (CLIFT) nachgewiesen. Zudem wurde die Proliferations- und Migrationskapazität sowie die Chemosensitivität der genom-editierten Zellen mittels optimiertem All-in-One Ansatz bestimmt, gefolgt von der Untersuchung der DDR-Signalwege durch Western Blot und Immunfluoreszenz. Überraschenderweise konnte bei Krebspatienten keine erhöhte Bindung von Autoantikörpern gegen LEDGF/p75 festgestellt werden, aber die Autoantikörperreaktivität auf LEDGF/p75 O/E-Zellen war bei etwa 50 % der Patienten mit BPH unerwartet erhöht. Auf molekularer Ebene zeigen LEDGF-defiziente Zellen eine verringerte Proliferation und Migration sowie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Chemotherapeutikum Etoposide auf. Auch eine signifikant verringerte DNA-Schadensantwort konnte sichtbar gemacht werden. Neue diagnostische Möglichkeiten unter Verwendung von HEp-2-Zellen mit Überexpression von LEDGF/p75 oder mitochondrialer DNA als Autoimmunziele könnten zur Identifizierung von BPH-Patienten mit Autoimmunreaktionen eingesetzt werden. Darüber hinaus zeigt diese Thesis, dass LEDGF nicht nur an der Rekrutierung von Proteinen der DNA-Schadensantwort beteiligt ist, sondern auch die proteosomale Regulierung von DDR-Signalmolekülen beeinflusst. KW - Y-H2AX KW - LEDGF/p75 KW - CRISPR/Cas9 KW - Prognostic biomarker KW - DNA damage signaling KW - Autoimmunity KW - DNA Reparatur KW - Darmkrebs KW - Autoimmunerkrankungen KW - Autoaggressionskrankheit KW - Prostatahypertrophie KW - Autoantigen KW - DNS-Reparatur Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-66988 ER -