TY - THES A1 - Schmidt, Jonas Paul Christian T1 - Nanopore sequencing in laboratory medicine : novel molecular diagnostic prospects for Familial Mediterranean fever and SARS-CoV-2 infections T1 - Nanopore-Sequenzierung in der Labormedizin : neue molekulardiagnostische Ansätze für Familiäres Mittelmeerfieber und SARS-CoV-2 Infektionen N2 - Nanopore sequencing, a third-generation sequencing technique that applies nanometre sized pores to transduce the physical and chemical properties of specific nucleobases into measurable electrical signals, shows attractive advantages over conventional next-generation sequencing techniques. However, primarily due to high sequencing error rates this technique has rarely been used so far in clinical laboratory diagnostics. In this cumulative dissertation Nanopore sequencing was established and validated in clinical diagnostics using the example of the molecular diagnosis of Familial Mediterranean fever (FMF) and SARS coronavirus-2 (SARS-CoV-2) infections. First, a novel data analysis pipeline for accurate single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping using Nanopore sequencing data was developed and validated with the corresponding sequencing protocol against conventional Sanger sequencing using 47 samples of patients with clinical suspicion of FMF. This method comparison showed a perfect agreement between both methods rendering current Nanopore sequencing in principle suitable for SNP genotyping in human genetics. The bioinformatic analysis of sequencing data is one of the most challenging parts in Nanopore sequencing experiments and complicates the application in a clinical diagnostic setting. Therefore, six different bioinformatic tools for sequence alignment were evaluated regarding their applicability to Nanopore sequencing data. This evaluation revealed a good suitability of all except one of these tools although differences in quality and performance exist. Since Nanopore sequencing showed a robust performance in SNP genotyping, a SARS-CoV-2 whole genome sequencing (WGS) protocol was established to enable onside viral WGS in a clinical laboratory. This was especially important for viral molecular biological surveillance during the pandemic as shown by analysing viral genetic data over the course of one year. Applying this approach in a clinical research project to investigate host-virus interaction by aggregating for the first time viral genetic data, serological data and clinical data, showed diverse humoral immune responses to SARS-CoV-2, that appear to be influenced by age, obesity and disease severity. Further, even small viral genetic changes may influence the clinical presentation of the associated disease COVID-19. Additionally, a novel reverse transcriptase (RT)- loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of SARS-CoV-2 was developed and validated for diagnostic use by method comparison with conventional RT-polymerase chain reaction (PCR). In summary, by presenting advancements of sequencing and bioinformatic workflows with the focus on an application in clinical diagnostics, the results of this thesis may pave the way for a broader application of Nanopore sequencing in laboratory medicine in the near future. N2 - Die Nanopore-Sequenzierung, eine Nukleinsäure-Sequenziertechnologie, bei der Poren im Nanometerbereich verwendet werden, um die molekularen Eigenschaften einzelner Nukleobasen in elektrisch messbare Signale umzuwandeln, weist einige Vorteile im Vergleich zu Next-Generation Sequenzierverfahren auf. Im Wesentlichen aufgrund einer hohen Fehlerrate wird die Technik bisher kaum in der klinischen Diagnostik verwendet. In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurde die Nanopore-Sequenzierung am Beispiel der molekularen Diagnostik von familiärem Mittelmeerfieber (FMF) und SARS Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) Infektionen für die klinische Diagnostik etabliert und validiert. Hierzu wurde zunächst eine neue Datenanalyse Pipeline für die zuverlässige Bestimmung von Einzelbasenaustauschen (SNPs) entwickelt und mit dem dazugehörigen Sequenzierprotokoll durch einen Methodenvergleich mit konventioneller Sanger-Sequenzierung unter Verwendung von 47 klinischen Proben von FMF-Patienten validiert. Dabei konnte eine perfekte Übereinstimmung zwischen beiden Methoden gezeigt werden, was die Anwendbarkeit der Technologie für SNP-Genotypisierung demonstriert. Die bioinformatische Auswertung der Daten stellt eine wesentliche Herausforderung bei der Durchführung von Nanopore-Sequenzierexperimenten dar und erschwert damit eine diagnostische Anwendung. Um dies zukünftig zu vereinfachen, wurden sechs verschiedene Sequenz-Alignment Programme hinsichtlich Ihrer Anwendbarkeit auf Nanopore-Sequenzierdaten überprüft. Dabei konnte gezeigt werden, dass trotz deutlicher Unterschiede in Qualität und Leistungsfähigkeit alle bis auf eines dieser Programme für die Analyse entsprechender Datensätze verwendet werden können. Da sich die Nanopore-Sequenzierung als gut geeignet für SNP-Genotypisierung erwies, wurde zusätzlich ein SARS-CoV-2 Vollgenom-Sequenzierprotokoll etabliert, um die Vollgenom-Sequenzierung im Diagnostiklabor zu ermöglichen. Dies hat sich insbesondere als wichtig für die molekularbiologische Surveillance im Rahmen der Pandemie erwiesen. Zusätzlich wurde das Vollgenom-Sequenzierprotokoll in einem klinischen Forschungsprojekt verwendet, um Wirt-Virus Interaktionen zu untersuchen, indem zum ersten Mal virale genetische Daten, serologische Daten und klinische Daten aggregiert ausgewertet wurden. Dabei konnte eine breit gefächerte humorale Immunantwort auf das Virus beobachtet werden, die im Wesentlichen von den Faktoren Alter, Übergewicht und dem Schweregrad der Erkrankung beeinflusst wurde. Außerdem konnte dargestellt werden, dass vermutlich schon kleine Veränderungen im viralen Genom das klinische Bild der assoziierten Erkrankung COVID-19 beeinflussen. Abschließend wurde im Rahmen der Dissertation eine neue reverse Transkriptase (RT)- Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Methode zum Nachweis von SARS-CoV-2 entwickelt und für die diagnostische Anwendung durch einen umfassenden Methodenvergleich mit konventioneller RT-Polymerasekettenreaktion (PCR) validiert. KW - Nanopore sequencing KW - Laboratory medicine KW - Molecular diagnostics KW - Familial Mediterranean fever KW - SARS-CoV-2 KW - Nanopore-Sequenzierung KW - Labormedizin KW - Molekulare Diagnostik KW - Familiäres Mittelmeerfieber KW - Familiäres Mittelmeerfieber KW - Labormedizin KW - Molekulare Diagnostik KW - Sequenzierung KW - SARS-CoV-2 KW - Diagnostics KW - Molecular medicine Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-63847 ER -