@phdthesis{Barig2013, author = {Barig, Susann}, title = {Beitr{\"a}ge zur Steigerung der industriellen Verwendung mikrobieller Lipasen : Produktion und Immobilisierung sowie Entwicklung eines quantitativen Nachweissystems}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-30624}, school = {BTU Cottbus - Senftenberg}, year = {2013}, abstract = {Lipasen sind esterolytische Enzyme, welche vorzugsweise an Lipid/Wasser Phasengrenzen aktiv sind. Von großer Bedeutung sind diese Biokatalysatoren bei etablierten industriellen Prozessen, wie z.B. in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie sowie der Herstellung von Detergenzien oder als Additiv in Waschmitteln. Neue Anwendungsgebiete, wie die Produktion von Feinchemikalien f{\"u}r die Pharma- und Agrarindustrie sowie die Herstellung von Biodiesel stellen Herausforderungen dar. Gerade in den letztgenannten Industriezweigen werden herk{\"o}mmlichen chemischen Verfahren bevorzugt, da die Herstellungskosten von Enzymen einen großtechnischen Einsatz behindern. Um die Kosten f{\"u}r den Einsatz des Biokatalysators zu minimieren, wurden drei Ansatzpunkte bearbeitet. Bei der Produktion von Lipasen oder anderen Enzymen durch Mikroorganismen fallen Investitions- und Betriebskosten an. Investitionskosten werden maßgeblich vom Reaktordesign und dessen Gr{\"o}ße bestimmt, wobei die Betriebskosten zum Beispiel durch den hohen Einsatz von Energie und Zeit bei der Sterilisation sowie teuren Medienbestandteilen festgesetzt werden. Aus dieser Betrachtung heraus wurde in vorhergehenden Arbeiten ein selektives Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik entwickelt, bei dem die Kosten f{\"u}r die Sterilisation entfallen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Maßstabsvergr{\"o}ßerung auf ein Volumen von 350 l durchgef{\"u}hrt. Die robuste Selektivit{\"a}t des Kultivierungssystems im 100-l- und 350-l-Maßstab wurde in 13 individuellen L{\"a}ufen {\"u}ber einen Kultivierungszeitraum von acht bis zw{\"o}lf Tagen mit dem Kompostisolat Phialemonium curvatum AW02 gezeigt. Der Mikroorganismus P. curvatum AW02 sowie dessen extrazellul{\"a}re Lipasen wurden partiell charakterisiert. Es zeigte sich, dass P. curvatum AW02 mindestens eine zellwandgebundenen Lipase sekretiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das selektive Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik das alleinige Wachstum weiterer bekannter Mikroorganismen, wie z.B. Aspergillus niger, Botrytis cinerea oder Yarrowia lipolytica beg{\"u}nstigt. Der zweite Ansatzpunkt zur Kostenminimierung ist die Wiederverwendung sowie Stabilisierung des Enzyms durch Immobilisierung, was intensive Entwicklungsarbeit voraussetzt. So wurde ein in der Handhabung leicht durchf{\"u}hrbares Immobilisierungsverfahren entwickelt, das auf der Einbettung wasserfreier Enzympr{\"a}parate in ein Polymer-Harz basiert. Dieses Enzym-Polymerharz-Gemisch kann auf Oberfl{\"a}chen mit unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften aufgebracht werden. Als Modellenzym wurde die robuste, Co-Faktor unabh{\"a}ngige, monomere Thermomyces lanuginosus Lipase (TLL) genutzt. Die Immobilisierung mittels wasserfreiem Einbettungsverfahren konnte erfolgreich mit Aktivit{\"a}ten von bis zu 250 mU/cm² beschichteter Oberfl{\"a}che gegen{\"u}ber p- Nitrophenyl-Palmitat (pNPPalm) nachgewiesen werden. Die Co-Faktor-abh{\"a}ngige und unter nativen Bedingungen als Homotetramer vorliegende Threonin Aldolase aus Ashbya gossypii wurde als zweites Beispielenzym erfolgreich mit dem wasserfreien Einbettungsverfahren immobilisiert. Somit konnte gezeigt werden, dass das neuartige wasserfreie Einbettungsverfahren auf verschiedene Enzyme mit unterschiedlicher Komplexit{\"a}t anwendbar ist. Der dritte Ansatzpunkt ist die Entwicklung eines quantitativen Mikrotiter-Lipase-Nachweissystems. Verschiedene labor- und zeitintensive Verfahren weisen lipolytische Aktivit{\"a}t nach. Um ein schnelles und einfaches Lipase-Nachweissystem zu etablieren, wurde ein turbidimetrisches Lipase-Nachweissystem im Mikroliter-Maßstab, basierend auf einer stabilisierten 1 \% (v/v) Tributyrinemulsion entwickelt. Durch die Hydrolyse des Tributyrins kommt es zu einer kontinuierlichen Kl{\"a}rung. Das Auftragen variabler Mengen des Modellenzyms TLL zeigte eine direkte Abh{\"a}ngigkeit zwischen Lipasekonzentration und Abnahme der Extinktion bei 595 nm. Eine eingehende Charakterisierung ergab, dass ein Substrat{\"u}berschuss bei 1 \% (v/v) Tributyrin vorliegt. Somit kann das turbidimetrische Mikrotiter-Lipase-Nachweissystem zur Quantifizierung lipolytischer Proben eingesetzt werden. Jeder der drei Ansatzpunkte tr{\"a}gt das Potential, robust und einfach, unter kostenminimierten Bedingungen Enzyme herzustellen, sie zu immobilisieren sowie lipolytische Aktivit{\"a}t zu quantifizieren. Daraus ergeben sich Anwendungsm{\"o}glichkeiten aber auch interessante wissenschaftliche Perspektiven.}, subject = {Pilze; Lipase; Selektive Kultivierung; Wasserfreie Immobilisierung von Enzymen; Mikrotiter-Platten Assay; Fungi; Lipase; Selective cultivation; Water-free immobilisation of enzymes; Microtiter plate assay; Pilze; Lipasen; Kultivierung; Enzym; Immobilisierung; Mikrotiter-Platte}, language = {de} } @phdthesis{Rudolf2024, author = {Rudolf, Jan}, title = {Entwicklung eines Horizontal-Laminar-Fluss-Reaktors zur Untersuchung der lipasekatalysierten Hydrolyse von Triglyceriden}, doi = {10.26127/BTUOpen-6789}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-67894}, school = {BTU Cottbus - Senftenberg}, year = {2024}, abstract = {Um die technische Nutzung und die Vergleichbarkeit der grenzfl{\"a}chenaktivierten Lipase aus dem Mikroorganismus Thermomyces lanuginosus zu verbessern, sollten die kinetischen Parameter unter Ber{\"u}cksichtigung der Gr{\"o}ße der reaktiven Grenzfl{\"a}che und der Stofftransportvorg{\"a}nge in Grenzfl{\"a}chenn{\"a}he ermittelt werden. Da bisher keine Versuchsanordnung die M{\"o}glichkeit zur parallelen Reaktionsuntersuchung und zur Str{\"o}mungsuntersuchung von Fl{\"u}ssig-Fl{\"u}ssigphasenreaktionen bot, wurde der Horizontal-Laminar-Fluss-Reaktor (HLFR) entwickelt und wesentliche Aspekte der Entwicklung eingehend beschrieben. Die Innovation des Reaktors bestand darin, dass eine kontinuierliche parallele Str{\"o}mung zweier nicht mischbarer fluider Phasen erm{\"o}glicht wurde. An einer gemeinsamen Phasengrenzfl{\"a}che mit einer konstanten Grenzfl{\"a}chengr{\"o}ße konnte die enzymatische Umsetzung stattfinden. Um den HLFR f{\"u}r eine kinetische Untersuchung anzuwenden, wurde das Mischungsverhalten mithilfe von Verweilzeitverteilungskurven aufgenommen und die Versuchsanordnung als Reaktorschaltung modelliert. Hierbei zeigte sich, dass unter Anwendung einer vergleichbaren Reaktionskinetik der Gesamtreaktor als kontinuierlich ger{\"u}hrter Satzreaktor modelliert werden kann. Zur Untersuchung der Stofftransporteinfl{\"u}sse auf die Reaktion sollte neben der Konzentrationsuntersuchung die Str{\"o}mungsvorg{\"a}nge innerhalb der Phasen messtechnisch zug{\"a}nglich gemacht werden. Aufgrund der begrenzten geometrischen Abmessungen wurde auf die Particle-Imaging-Velocimetry zur{\"u}ckgegriffen. Notwendige Anpassungen an der Versuchsanordnung zur Integration der Messmethode und eine Validierung der Str{\"o}mungsmessung wurden detailliert beschrieben. Anschließend an die Entwicklung der Versuchsanordnung wurde am Beispiel der Lipase aus dem Mikroorganismus Thermomyces lanoginosus die Bestimmung der kinetischen Parameter f{\"u}r die Hydrolyse von nativen Raps{\"o}l mithilfe eines Michaelis-Menten-Ansatzes mit kompetitiver Produkthemmung durchgef{\"u}hrt. Die Ermittlung des Reaktionsfortschritts erfolgte durch Messung der Konzentration der freien Fetts{\"a}uren in der {\"O}lphase durch nicht w{\"a}ssrige Titration. Zur Berechnung der kinetischen Parameter wurde sowohl die Differentialmethode als auch die Integralmethode angewendet. Parallel wurden die gewonnenen Daten mit den beobachteten Str{\"o}mungsprofilen der PIV-Messung kombiniert und ein m{\"o}glicher Einfluss der Schubspannung in Grenzfl{\"a}chenn{\"a}he als maßgeblicher Faktor f{\"u}r die effektive Reaktionsgeschwindigkeit diskutiert. Des Weiteren konnte eine bereits durch die Literatur beschriebene Abh{\"a}ngigkeit zwischen dem Str{\"o}mungszustand im Reaktionssystem und der Reaktionsgeschwindigkeit best{\"a}tigt werden. Als Ergebnis der Untersuchung wurde f{\"u}r die untersuchte Lipase unter Anwendung von nativen Raps{\"o}l als Substrat eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit von 2,1 mmol/m^2min und eine Inhibierungskonstante f{\"u}r das Produkt von 6,88 mol/m^3 ermittelt.}, subject = {Thermomyces lanoginosus; PIV; Zweiphasenstr{\"o}mung; Two-phase-flow; Lipase; Lipase; Zweiphasenstr{\"o}mung; Rohrreaktor; Hydrolyse; Reaktionskinetik}, language = {de} }