@phdthesis{Barig2013, author = {Barig, Susann}, title = {Beitr{\"a}ge zur Steigerung der industriellen Verwendung mikrobieller Lipasen : Produktion und Immobilisierung sowie Entwicklung eines quantitativen Nachweissystems}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-30624}, school = {BTU Cottbus - Senftenberg}, year = {2013}, abstract = {Lipasen sind esterolytische Enzyme, welche vorzugsweise an Lipid/Wasser Phasengrenzen aktiv sind. Von großer Bedeutung sind diese Biokatalysatoren bei etablierten industriellen Prozessen, wie z.B. in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie sowie der Herstellung von Detergenzien oder als Additiv in Waschmitteln. Neue Anwendungsgebiete, wie die Produktion von Feinchemikalien f{\"u}r die Pharma- und Agrarindustrie sowie die Herstellung von Biodiesel stellen Herausforderungen dar. Gerade in den letztgenannten Industriezweigen werden herk{\"o}mmlichen chemischen Verfahren bevorzugt, da die Herstellungskosten von Enzymen einen großtechnischen Einsatz behindern. Um die Kosten f{\"u}r den Einsatz des Biokatalysators zu minimieren, wurden drei Ansatzpunkte bearbeitet. Bei der Produktion von Lipasen oder anderen Enzymen durch Mikroorganismen fallen Investitions- und Betriebskosten an. Investitionskosten werden maßgeblich vom Reaktordesign und dessen Gr{\"o}ße bestimmt, wobei die Betriebskosten zum Beispiel durch den hohen Einsatz von Energie und Zeit bei der Sterilisation sowie teuren Medienbestandteilen festgesetzt werden. Aus dieser Betrachtung heraus wurde in vorhergehenden Arbeiten ein selektives Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik entwickelt, bei dem die Kosten f{\"u}r die Sterilisation entfallen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Maßstabsvergr{\"o}ßerung auf ein Volumen von 350 l durchgef{\"u}hrt. Die robuste Selektivit{\"a}t des Kultivierungssystems im 100-l- und 350-l-Maßstab wurde in 13 individuellen L{\"a}ufen {\"u}ber einen Kultivierungszeitraum von acht bis zw{\"o}lf Tagen mit dem Kompostisolat Phialemonium curvatum AW02 gezeigt. Der Mikroorganismus P. curvatum AW02 sowie dessen extrazellul{\"a}re Lipasen wurden partiell charakterisiert. Es zeigte sich, dass P. curvatum AW02 mindestens eine zellwandgebundenen Lipase sekretiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das selektive Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik das alleinige Wachstum weiterer bekannter Mikroorganismen, wie z.B. Aspergillus niger, Botrytis cinerea oder Yarrowia lipolytica beg{\"u}nstigt. Der zweite Ansatzpunkt zur Kostenminimierung ist die Wiederverwendung sowie Stabilisierung des Enzyms durch Immobilisierung, was intensive Entwicklungsarbeit voraussetzt. So wurde ein in der Handhabung leicht durchf{\"u}hrbares Immobilisierungsverfahren entwickelt, das auf der Einbettung wasserfreier Enzympr{\"a}parate in ein Polymer-Harz basiert. Dieses Enzym-Polymerharz-Gemisch kann auf Oberfl{\"a}chen mit unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften aufgebracht werden. Als Modellenzym wurde die robuste, Co-Faktor unabh{\"a}ngige, monomere Thermomyces lanuginosus Lipase (TLL) genutzt. Die Immobilisierung mittels wasserfreiem Einbettungsverfahren konnte erfolgreich mit Aktivit{\"a}ten von bis zu 250 mU/cm² beschichteter Oberfl{\"a}che gegen{\"u}ber p- Nitrophenyl-Palmitat (pNPPalm) nachgewiesen werden. Die Co-Faktor-abh{\"a}ngige und unter nativen Bedingungen als Homotetramer vorliegende Threonin Aldolase aus Ashbya gossypii wurde als zweites Beispielenzym erfolgreich mit dem wasserfreien Einbettungsverfahren immobilisiert. Somit konnte gezeigt werden, dass das neuartige wasserfreie Einbettungsverfahren auf verschiedene Enzyme mit unterschiedlicher Komplexit{\"a}t anwendbar ist. Der dritte Ansatzpunkt ist die Entwicklung eines quantitativen Mikrotiter-Lipase-Nachweissystems. Verschiedene labor- und zeitintensive Verfahren weisen lipolytische Aktivit{\"a}t nach. Um ein schnelles und einfaches Lipase-Nachweissystem zu etablieren, wurde ein turbidimetrisches Lipase-Nachweissystem im Mikroliter-Maßstab, basierend auf einer stabilisierten 1 \% (v/v) Tributyrinemulsion entwickelt. Durch die Hydrolyse des Tributyrins kommt es zu einer kontinuierlichen Kl{\"a}rung. Das Auftragen variabler Mengen des Modellenzyms TLL zeigte eine direkte Abh{\"a}ngigkeit zwischen Lipasekonzentration und Abnahme der Extinktion bei 595 nm. Eine eingehende Charakterisierung ergab, dass ein Substrat{\"u}berschuss bei 1 \% (v/v) Tributyrin vorliegt. Somit kann das turbidimetrische Mikrotiter-Lipase-Nachweissystem zur Quantifizierung lipolytischer Proben eingesetzt werden. Jeder der drei Ansatzpunkte tr{\"a}gt das Potential, robust und einfach, unter kostenminimierten Bedingungen Enzyme herzustellen, sie zu immobilisieren sowie lipolytische Aktivit{\"a}t zu quantifizieren. Daraus ergeben sich Anwendungsm{\"o}glichkeiten aber auch interessante wissenschaftliche Perspektiven.}, subject = {Pilze; Lipase; Selektive Kultivierung; Wasserfreie Immobilisierung von Enzymen; Mikrotiter-Platten Assay; Fungi; Lipase; Selective cultivation; Water-free immobilisation of enzymes; Microtiter plate assay; Pilze; Lipasen; Kultivierung; Enzym; Immobilisierung; Mikrotiter-Platte}, language = {de} } @phdthesis{Saulich2008, author = {Saulich, Katja}, title = {Reaktionskinetische Experimente zur Lipase-katalysierten Hydrolyse von Raps{\"o}l in Wasser-in-{\"O}l-Emulsionen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:co1-opus-5975}, school = {BTU Cottbus - Senftenberg}, year = {2008}, abstract = {Mit zunehmender Knappheit an Energieressourcen und den daraus resultierenden hohen Energiekosten entwickelt sich ein Bedarf, energieintensive Verfahren der produzierenden Industrie durch Verfahren geringeren Energiebedarfs und h{\"o}herer Produktselektivit{\"a}t zu ersetzen. In der stoffumwandelnden Industrie kommen als Substitutionsverfahren biokatalytische Prozesse in Frage. Als Voraussetzung f{\"u}r eine kommerzielle Anwendung von Enzymprozessen ist ein quantitatives und qualitatives Verst{\"a}ndnis der grundlegenden physikalischen und chemischen Ph{\"a}nomene, die diesen Prozessen obliegen, notwendig. Die Hydrolyse von {\"O}len und Fetten ist ein Beispiel, bei dem die Produkte neben dem technisch etablierten Verfahren alternativ biokatalytisch herstellbar sind. Zur Reaktorauslegung sowie f{\"u}r eine optimale Prozessf{\"u}hrung ist die Kenntnis der Reaktionskinetik notwendig. Die Kinetik dieser heterogenen Reaktion wird maßgeblich durch Qualit{\"a}t und Quantit{\"a}t der Phasengrenzfl{\"a}che sowie dem Enzymverhalten (Aktivit{\"a}t, Stabilit{\"a}t) w{\"a}hrend der Reaktion bestimmt. Diese Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der ph{\"a}nomenologischen Beschreibung der Reaktionskinetik auf der Basis von kinetischen Untersuchungen f{\"u}r die biokatalytische Hydrolyse von Raps{\"o}l in einer w/o-Emulsion (25 Vol.-\% w{\"a}ssrige Phase). Dabei galt es, den Reaktionsfortschritt (Fourier-Transformations-Infrarot(FTIR)-Absorptionsspektroskopie) und die Phasengrenzfl{\"a}che (Photonendichtewellen(PDW)-Spektroskopie) in hoher zeitlicher Aufl{\"o}sung zu messen sowie Einfl{\"u}sse wie Temperatur, pH-Wert, Substratverh{\"a}ltnis und R{\"u}hrergeschwindigkeit auf das Enzymverhalten zu bestimmen. Mit dem Ziel, eine wirtschaftliche Lipasekonzentration absch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen, wurden zudem Kenntnisse bez{\"u}glich des Lipase- und Fetts{\"a}ureverhaltens an der Grenzfl{\"a}che mittels der Pendant-Drop-Methode w{\"a}hrend der Reaktion gewonnen.}, subject = {Raps{\"o}l; Wasser-in-{\"O}l-Emulsion; Hydrolyse; Lipase; FTIR; Reaktionskinetik; PDW-Spektroskopie; Pendant-Drop; Lipase; FTIR; Reaction kinetics; PDW-Spectroscopy; Pendant-Drop}, language = {de} }