TY - THES A1 - Barig, Susann T1 - Beiträge zur Steigerung der industriellen Verwendung mikrobieller Lipasen : Produktion und Immobilisierung sowie Entwicklung eines quantitativen Nachweissystems T1 - Contributions to increase the industrial application of microbial lipases : Production, immobilisation and development of a quantitative assay system N2 - Lipasen sind esterolytische Enzyme, welche vorzugsweise an Lipid/Wasser Phasengrenzen aktiv sind. Von großer Bedeutung sind diese Biokatalysatoren bei etablierten industriellen Prozessen, wie z.B. in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie sowie der Herstellung von Detergenzien oder als Additiv in Waschmitteln. Neue Anwendungsgebiete, wie die Produktion von Feinchemikalien für die Pharma- und Agrarindustrie sowie die Herstellung von Biodiesel stellen Herausforderungen dar. Gerade in den letztgenannten Industriezweigen werden herkömmlichen chemischen Verfahren bevorzugt, da die Herstellungskosten von Enzymen einen großtechnischen Einsatz behindern. Um die Kosten für den Einsatz des Biokatalysators zu minimieren, wurden drei Ansatzpunkte bearbeitet. Bei der Produktion von Lipasen oder anderen Enzymen durch Mikroorganismen fallen Investitions- und Betriebskosten an. Investitionskosten werden maßgeblich vom Reaktordesign und dessen Größe bestimmt, wobei die Betriebskosten zum Beispiel durch den hohen Einsatz von Energie und Zeit bei der Sterilisation sowie teuren Medienbestandteilen festgesetzt werden. Aus dieser Betrachtung heraus wurde in vorhergehenden Arbeiten ein selektives Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik entwickelt, bei dem die Kosten für die Sterilisation entfallen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Maßstabsvergrößerung auf ein Volumen von 350 l durchgeführt. Die robuste Selektivität des Kultivierungssystems im 100-l- und 350-l-Maßstab wurde in 13 individuellen Läufen über einen Kultivierungszeitraum von acht bis zwölf Tagen mit dem Kompostisolat Phialemonium curvatum AW02 gezeigt. Der Mikroorganismus P. curvatum AW02 sowie dessen extrazelluläre Lipasen wurden partiell charakterisiert. Es zeigte sich, dass P. curvatum AW02 mindestens eine zellwandgebundenen Lipase sekretiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das selektive Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik das alleinige Wachstum weiterer bekannter Mikroorganismen, wie z.B. Aspergillus niger, Botrytis cinerea oder Yarrowia lipolytica begünstigt. Der zweite Ansatzpunkt zur Kostenminimierung ist die Wiederverwendung sowie Stabilisierung des Enzyms durch Immobilisierung, was intensive Entwicklungsarbeit voraussetzt. So wurde ein in der Handhabung leicht durchführbares Immobilisierungsverfahren entwickelt, das auf der Einbettung wasserfreier Enzympräparate in ein Polymer-Harz basiert. Dieses Enzym-Polymerharz-Gemisch kann auf Oberflächen mit unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften aufgebracht werden. Als Modellenzym wurde die robuste, Co-Faktor unabhängige, monomere Thermomyces lanuginosus Lipase (TLL) genutzt. Die Immobilisierung mittels wasserfreiem Einbettungsverfahren konnte erfolgreich mit Aktivitäten von bis zu 250 mU/cm² beschichteter Oberfläche gegenüber p- Nitrophenyl-Palmitat (pNPPalm) nachgewiesen werden. Die Co-Faktor-abhängige und unter nativen Bedingungen als Homotetramer vorliegende Threonin Aldolase aus Ashbya gossypii wurde als zweites Beispielenzym erfolgreich mit dem wasserfreien Einbettungsverfahren immobilisiert. Somit konnte gezeigt werden, dass das neuartige wasserfreie Einbettungsverfahren auf verschiedene Enzyme mit unterschiedlicher Komplexität anwendbar ist. Der dritte Ansatzpunkt ist die Entwicklung eines quantitativen Mikrotiter-Lipase-Nachweissystems. Verschiedene labor- und zeitintensive Verfahren weisen lipolytische Aktivität nach. Um ein schnelles und einfaches Lipase-Nachweissystem zu etablieren, wurde ein turbidimetrisches Lipase-Nachweissystem im Mikroliter-Maßstab, basierend auf einer stabilisierten 1 % (v/v) Tributyrinemulsion entwickelt. Durch die Hydrolyse des Tributyrins kommt es zu einer kontinuierlichen Klärung. Das Auftragen variabler Mengen des Modellenzyms TLL zeigte eine direkte Abhängigkeit zwischen Lipasekonzentration und Abnahme der Extinktion bei 595 nm. Eine eingehende Charakterisierung ergab, dass ein Substratüberschuss bei 1 % (v/v) Tributyrin vorliegt. Somit kann das turbidimetrische Mikrotiter-Lipase-Nachweissystem zur Quantifizierung lipolytischer Proben eingesetzt werden. Jeder der drei Ansatzpunkte trägt das Potential, robust und einfach, unter kostenminimierten Bedingungen Enzyme herzustellen, sie zu immobilisieren sowie lipolytische Aktivität zu quantifizieren. Daraus ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten aber auch interessante wissenschaftliche Perspektiven. N2 - Lipases are esterolytic enzymes preferring the lipid/water interface for activity. They are of interest in industrial processes, i.e. dietary and food industry, the production of detergents as well as additives for cleaning agents. The application in other industrial fields, such as the production of fine chemicals for pharmaceutical and agro-chemical usage and the production of biodiesel, is still a challenge. Especially, in the last mentioned industrial areas biotechnical processes compete with traditional chemical methods. Mostly, the high production costs of enzymes hinder the application of enzymes in industrial processes. Therefore, three aspects were studied to minimize the costs for the usage of a biocatalyst. During the production process of lipases or other enzymes capital and operating costs are accumulated. The capital costs are mainly determined by the reactor design and dimension. Energy and time consuming sterile technique as well as expensive media components are increasing the operating costs. In previous experiments of the working group a selective cultivation system with minimized sterile technique was developed to reduce the mentioned expenses. In the presented thesis it was shown that a scale up to a culture volume of 350 l was possible. Robustness of the cultivation system in 100-l- and 350-l-scale was confirmed by 13 individual runs during cultivation periods of eight to twelve days of Phialemonium curvatum AW02 derived from a compost pile. The microorganism P. curvatum AW02 as well as its extracellular lipases were partially characterized. It was shown that P. curvatum AW02 secretes a minimum of one cell wall associated lipase. The growth of further well-known microorganisms such as Asperillus niger, Botrytis cinerea and Yarrowia lipolytica, in the cultivation system with minimized sterile technique was possible. A second approach to minimize the costs was the re-use and stabilization of enzymes by immobilisation which implies intensive work. Therefore, an immobilisation method was developed which is easy in performance. The method is based on the entrapment of water-free enzyme preparations in a polymeric resin. The enzyme/polymeric resin mixture can be applied on different surfaces varying in physical and chemical properties. As model enzyme the robust, co-factor independent and monomeric Thermomyces lanuginosus Lipase (TLL) was used. The immobilisation by water-free entrapment was successfully carried out. Activities of up to 250 mU/cm² coated surface were determined using p-nitrophenyl-palmitate (pNPPalm) as substrate. As a second example the more complex threonine aldolase of Ashbya gossypii was successfully applied in water-free entrapment. The main difference to TLL is the co-factor dependency and the homotetrameric superstructure of the threonine aldolase. Concluding to these results, the newly developed immobilisation method on the basis of water-free entrapment is applicable on enzymes varying in their complexity. The third approach was the development of a quantitative turbidity assay for lipolytic enzymes in microliter-scale. Many laboratory- and time-intensive methods determining lipolytic activity are known. The goal was to establish a simple and fast assay system. Therefore, an assay in microliter scale was established which basically consists of a stabilized 1 % (v/v) tributyrin/water emulsion. Hydrolysis of tributyrin causes a continuous clearing which can be followed at 595 nm by spectrophotometry. Different amounts of the model enzyme TLL showed a direct dependency between lipase concentration and decrease of extinction. A detailed characterization proved that substrate excess is given at 1 % (v/v) tributyrin. Therefore, the turbidity assay in microtiter plates can be used to quantitatively determine lipolytic enzymes. Each of the three different aspects has the potential to be robust, simple and cost-effective in respect to produce enzymes, immobilize enzymes or determine lipolytic activity. Consequentially, different application fields arose from the presented data. Furthermore, interesting scientific questions arose and might stimulate further research. KW - Pilze KW - Lipase KW - Selektive Kultivierung KW - Wasserfreie Immobilisierung von Enzymen KW - Mikrotiter-Platten Assay KW - Fungi KW - Lipase KW - Selective cultivation KW - Water-free immobilisation of enzymes KW - Microtiter plate assay KW - Pilze KW - Lipasen KW - Kultivierung KW - Enzym KW - Immobilisierung KW - Mikrotiter-Platte Y1 - 2014 UR - https://opus4.kobv.de/opus4-btu/frontdoor/index/index/docId/3062 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-30624 ER -