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Die neue Crosslinking-Methode ist hilfreich, um Immunglobuline des Isotyps G ortspezifisch an ihrer Bindungsstelle mit Protein A oder G zu konjugieren. Die Kopplungen von Protein A und G konnten erfolgreich an Maus- und Human-IgG durchgeführt, sowie die Bedingungen untersucht und optimiert werden. Die Aktivierung von Protein G mit Glutaraldehyd erfolgt am besten bei pH 8 und die anschließende Kopplung mit Maus-IgG1 bei einem pH-Wert von 6. Jedoch wurden mit SIAB und Sulfo-SIAB als Crosslinker im Vergleich zu Glutaraldehyd noch höhere Signale erhalten. Für die Kopplung von SIAB sind 40% DMSO im Reaktionspuffer günstig, währenddessen Sulfo-SIAB gut wasserlöslich ist daher keine Lösungsvermittler benötigt. Es ergab sich ein optimaler pH-Wert von 7,4 um Protein A mit SIAB zu aktivieren und den gleichen pH-Wert um die Kopplung mit Maus-IgG1 durchzuführen. Für die Kopplung von Protein G mit Maus-IgG1 hingegen zeigten die Experimente, dass ein leicht saurer pH-Wert bei pH 6 für den IgG-Kopplungsschritt am günstigsten ist. Während die Inkubationszeit von Maus-IgG1 mit Protein G bei 16 h liegt, muss mit Protein A bis zu 40 h inkubiert werden, um das Kopplungsmaximum zu erreichen. Des Weiteren wurde das Crosslinking von Human-IgG (Herceptin) mit SIAB untersucht. Dabei zeigte sich, wie in der Abbildung 47 zu sehen ist, dass Protein A und G vergleichbar gut an Human-IgG zu koppeln sind. Für das Crosslinking von Protein G mit Maus-IgG1 ist dagegen ein deutlich besserer Umsatz im Vergleich zu Protein A zu erkennen (Abbildung 48). Heterobifunktionale Linker können mit der reaktiveren Gruppe die erste Bindung eingehen, um erst nach Zugabe eines weiteren Reagenzes die zweite Bindung auszubilden und zudem intramolekulare Reaktionen möglichst zu vermeiden.
Im Vergleich zu anderen Proteinen ist die Identifizierung von Antikörpern anhand ihrer Sequenz zum Beispiel mittels "peptide mass fingerprinting" schwierig. Da die Sequenzinformation eines Antikörpers aufgrund der hypersomatischen Mutation während der Affinitätsreifung nicht im Genom eines Organismus gespeichert ist, kann die Aminosäuresequenz nicht auf einfachem Weg der DNA-Sequenzierung gewonnen werden. Das ist nur in seltenen Fällen möglich, wenn dem Endanwender der Zellklon der Antikörper-produzierenden Zelle zugänglich ist. Eine Sequenzierung auf Protein-Ebene ist sehr aufwändig und teuer und wird daher fast nie für die Charakterisierung von analytischen Antikörpern verwendet. Der Mangel an Validierung dieser analytischen Antikörper, die bei Experimenten verwendeten werden, löst aber eine Reihe Probleme aus, die die Wiederholbarkeit dieser Experimente schwierig und in einigen Fällen unmöglich macht. Das sorgt jährlich für verschwendete Forschungsgelder in Milliardenhöhe und hindert den wissenschaftlichen Fortschritt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer einfachen und schnellen Methode, die es trotzdem ermöglicht, die Identifikation von Antikörpern sicherzustellen. Dazu wurde eine Methode basierend auf dem "peptide mass fingerprinting" gewählt. Das Problem der unbekannten Aminosäuresequenz der Antikörper wurde gelöst, indem lediglich die Peptidmuster der entstehenden Fingerprint-Spektren zur Identifikation herangezogen wurden. MALDI wurde dabei als Ionisationsmethode für die Massenspektrometrie gewählt, da die resultierenden Spektren im Gegensatz zu ESI-MS einfach auszuwerten sind. Auch kann auf eine vorige Trennung der Peptide mittels LC verzichtet werden, was zusätzlich Analysenzeit spart. Für die Proteinspaltung wurde eine simple saure Hydrolyse mittels Ameisensäure gewählt. Im Vergleich zum herkömmlichen Trypsin-Verdau konnten auf zeitraubende Arbeitsschritte wie Denaturierung, Reduktion und Alkylierung der Antikörper verzichtet werden. Die Hydrolyse mittels Ameisensäure wurde bisher nur auf kleine und mittelgroße Proteine angewendet, sodass im ersten Teil dieser Arbeit mehrere Schritte optimiert wurden bevor zufriedenstellende Fingerprint-Spektren von Antikörpern erhalten wurden.
Die Identifizierung von Transformationsprodukten (TPs) von Tierarzneimittelwirkstoffen ist wichtig für Gesundheit, Lebensmittel und Umwelt. Monensin (MON) gehört zu den Ionophoren Antibiotika und wird genutzt zum Schutz und zur Behandlung von Kokzidiose bei Geflügel, vorwiegend prophylaktisch in der Geflügelmast. Rückstände können in tierischen Produkten (Geflügel und Eier) aber auch in der Umwelt (Tiermist, Gewässer, Böden) gefunden werden. Verschiedene Transformationsprozesse können auftreten, beginnend bei der Biotransformation in lebenden Organismen bis hin zu biotischen und abiotischen Prozessen in der Umwelt.
Die Kopplung von Elektrochemie und Massenspektrometrie, kurz EC/HRMS, als rein instrumenteller Ansatz zur Simulation von Transformationsprodukten ist seit vielen Jahren in der pharmazeutischen Forschung etabliert. Hierbei wird mithilfe einer elektrochemischen Durchflusszelle der oxidative Metabolismus einer Substanz simuliert und zugleich analysiert. Unter Verwendung von EC/HRMS und LC-HRMS wurde MON elektrochemisch bei Potentialen bis zu 2.5 V vs Pd/H2 oxidiert und die entstehenden TPs mit Metabolismustests mit Rattenlebermikrosomen verglichen. Als Ergebnis wurden verschiedene TPs von MON gefunden und Strukturvorschläge wurden erstellt. Ein Überblick über die detektierten und identifizierten TPs wird dargestellt.
Früh- bis spätmittelalterliche Stuckausstattungen bilden ein regionales, da an Gips-vorkommen korreliertes kunsttechnologisches Spezifikum. Aufgrund der beschränkten Kontrollmöglichkeiten über die in einem Meiler oder Feldofen herrschenden Parameter charakterisiert mittelalterliche Hochbrandgipse ein Phasengemisch aus Calciumsulfat-Hydratstufen und thermisch mehr oder weniger stark geschädigten Nebenbestandteilen aus der Gipslagerstätte. Die Analyse mittelalterlicher Hochbrandgipse erfordert die genaue Kenntnis der Bildungs- und Stabilitätsbereiche der Phasen im System CaSO4–H2O. Gips CaSO4 x 2 H2O entwässert beim Brennen über Halbhydrat CaSO4 x 0.5 H2O zu Anhydrit III CaSO4, welches schließlich in den für mittelalterliche Hochbrandgipse relevanten Anhydrit II (AII) übergeht. Für diesen wurden aufgrund der Abbindeeigenschaften drei bis vor kurzem nicht spektroskopisch unterscheidbare Sub-Phasen postuliert: Anhydrit II schwerlöslich (300-500°C, AII-s), unlöslich (500-700°C, AII-u) und Estrichgips (> 700°C, AII-E). Anhydrit I ist nur über 1180°C stabil.
Mittels strukturanalytischer Methoden wie Röntgenbeugung (XRD) und Raman-Spektroskopie lassen sich nur die verschiedenen Hydratstufen sowie AIII, AII und AI eindeutig aufgrund unterschiedlicher Kristallstrukturen identifizieren. Ein neues auf Raman-mikrospektroskopischer Bildgebung basierendes Verfahren ermöglicht den Nachweis verschiedener Brenntemperaturen aufgrund der Auswertung von Raman-Bandenbreiten von AII, welche ein Maß für die mit steigender Brenntemperatur zunehmende Kristallinität der Anhydritkörner sind.
Die Anwendung dieser Methode sowie der Nachweis pyrometamorpher Umwandlun-gen von Begleitmineralien aus dem Gipsstein als Mineralthermometer zur Bestimmung von Brenntemperaturen wird anhand von Proben früh- und spätmittelalterlicher Skulpturen und Stuckdekorationen aus Südtirol diskutiert. Außerdem wird gezeigt, wie die Analyse solch komplexer Materialien Rückkopplungen in die Analytische Chemie erzeugen kann, da zur erfolgreichen Analytik eine Möglichkeit zur reproduzierbaren Bestimmung von Ramanbandenbreiten und der Korrektur instrumentenabhängiger Verbreiterung gefunden und optimiert werden musste.
Damit sollten überzeugende Belege dafür erbracht werden können, dass die Komplexität des monomineralischen Bindemittels Gips bezüglich der je nach Brandbedingungen unterschiedlichen Eigenschaften und insbesondere bezüglich der Herausforderungen an die Analytische Chemie häufig unterschätzt wird.
The use of high-fired gypsum as binder for masonry and joint mortars or stuccowork in Central Europe in the Early and High Middle Ages was a regional specific as it depended on local gypsum deposits. The calcination technology possible at the time resulted in an assemblage of calcium sulphate phases dehydrated to different degrees and partly thermally damaged accessory minerals of the raw gypsum. Not hydrated clusters of firing products preserved in the binder matrix are a typical feature of such mortars. A novel Raman microspectroscopic approach, providing access to the burning history of individual anhydrite grains, was applied to samples from medieval South Tyrolean stucco decorations and sculptures. Beyond that, Raman microspectroscopy was employed for tracing and visualising pyrometamorphic reactions in natural impurities of the kiln run. In the discussed examples mineral thermometry indicates process temperatures above 800°C: the breakdown of magnesium-rich chlorite led to the formation of forsterite Mg2SiO4, while the thermal decomposition of dolomite CaMg(CO3)2 to periclase MgO and lime CaO yielded – after hydration and carbonation – magnesite MgCO3, CaCO3 polymorphs and magnesian calcite. Hydration of periclase in the mixed gypsum paste containing sulphate ions also resulted in magnesium sulphate hydrates, here identified in the form of hexahydrite MgSO4·6H2O. Lower burning temperatures left the accessory minerals in their pristine form, but can be traced by measuring the spectra of individual anhydrite crystals in grains of firing products and evaluating Raman band widths. Throughout the present study, calcination temperatures ranging from approx. 600°C to 900°C were determined.
In this study the direct and indirect photolysis of the novel brominated flame retardant 2,4,6-Tris-(2,4,6-tribromophenoxy)-1,3,5-triazine (TTBP-TAZ) in an organic solvent mixture (60:30:10, ACN:MeOH:THF) under UV-(C) and simulated sunlight irradiation was investigated, and the formed photo-transformation products were identified for the first time. TTBP-TAZ was almost completely degraded within 10 min under UV-(C) irradiation. Due to the fast degradation no specific kinetic order could be observed. In comparison, the reaction under simulated sunlight irradiation was much slower and thus, the kinetic first-order could be determined. The observed photolysis rate constant k as well as the half-life time t1/2 were estimated to be k = (0.0163 ± 0.0002) h-1 and t1/2 = 42.3 h, respectively. The addition of 2-propanol and hydrogen peroxide to investigate the influence of indirect photolysis under UV-(C) irradiation causes no influence on the degradation of TTBP-TAZ. Nevertheless, the removal of TTBP-TAZ under UV-(C) and simulated sunlight without additional chemicals (except solvent) indicates that the direct photolysis plays a significant role in the degradation mechanism of TTBP-TAZ. In both irradiation experiments, TTBP-TAZ was quantitatively degraded that involve the formation of previously unknown PTPs. Overall, two main PTPs were determined when irradiated with UV-(C) and eight sequential debromination products were observed when irradiated by simulated sunlight. These were determined by HPLC-DAD and - MS/(MS), respectively. Based on the chosen experimental conditions the consecutive debromination as well as photo-Fries rearrangement was confirmed as the main degradation pathway by high resolution mass spectrometry and X-ray diffraction.
Metal oxide/graphene photocatalysts have been attracting considerable attention in solving environmental pollution problems because of the limitations of the semiconductor-based photocatalysts. In this study, highly efficient and inexpensive zinc oxide (ZnO) nanoparticles with three different morphologies, such as nanospheres, nanodisks, and nanorods, anchored on reduced graphene oxide (RGO) were synthesized in solvent mixtures with different ethanol to water ratios. Among the three morphologies, the nanospherical ZnO/RGO (sZG) Composite exhibited the highest methylene blue (MB) and rhodamine B removal efficiencies at 99% and 98%, respectively, after only 60 min under low-power (40 W) ultraviolet irradiation at a low catalyst loading of 0.1 g L−1. This nanocomposite also showed excellent photocatalytic stability under UV irradiation, retaining 96% Efficiency even after 15 cycles of MB degradation. Moreover, the sZG composite exhibited a high MB degradation Efficiency of approximately 99% after 100 min at a low catalyst loading of 0.2 g L−1 under solar light illumination. The
excellent photocatalytic performance and high stability of this low-cost nanospherical ZnO/RGO Composite exemplarily highlights the potential of sustainable next-generation photocatalysis for treating wastewater containing organic pollutants.
The simultaneous detection of different analytes has gained increasing importance in recent years, especially in the fields of environmental and health monitoring. Particularly suitable formats for multiplexing are bead-based assays. The beads employed need to fulfil size and density requirements important for instance for flow cytometry and shall exhibit an as high as possible surface area for anchoring capture probes to allow for low limits of detection. Core/shell particles are ideally suited in this sense because of their modularity in design and adaptability for various (bio)analytical assays. Here, polystyrene particles coated with different kinds of mesoporous silica shells are presented, possessing distinctly higher surface areas in comparison to non-porous core/shell particles. Different factors such as pH and amount and type of mediator salt used during shell preparation were evaluated with shell inspection by scanning/transmission scanning electron microscopy (SEM/tSEM) being key to architecture control of the monodisperse particles.
For a cytometric model assay, the optimized core/shell particles were functionalized with capture oligonucleotides for DNA detection. After covalent attachment of single-stranded DNA to the silane-modified silica surface, a hybridisation assay using labelled t-DNA complementary strands was carried out to demonstrate particle performance, showing how tailoring of the shell’s surface area controls sensitivity and dynamic range of the assay. Finally, a multiplex assay for the determination of DNA from different human papilloma virus (HPV) lines was developed. Using our optimized particles, we were able to detect down to 10 amolμl‒1, which is an improvement of one order of magnitude compared to assays using non-porous particles reported in the literature. In addition, multiplexed detection could successfully be demonstrated.
What isotopes can do...
(2019)