Chemische Charakterisierung und Spurenanalytik
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Ergot alkaloids, potent mycotoxins produced by Claviceps spp., particularly Claviceps purpurea, pose significant health risks when they contaminate rye and related cereals, leading to ergotism in humans and mammals [1]. In response, the European Union has established Regulation 2023/915, setting maximum residue levels for the sum of 12 principal ergot alkaloids and other mycotoxins including fumonisins (FUM), deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZEN), and T2/HT2 toxins in food products. Given the prevalent co-occurrence of mycotoxins, their simultaneous detection is crucial for ensuring the safety of food and feed [2, 3].
Traditionally, chromatographic techniques such as liquid chromatography coupled with (tandem) mass spectrometry (LC-MS/MS) have been employed for multiplex detection of mycotoxins [4, 5]. While effective, these methods require specialized facilities, expensive equipment, and skilled personnel. Immunoassays like ELISA and lateral flow assays offer a more accessible alternative for rapid mycotoxin detection, yet they generally lack the capability for concurrent multi-toxin screening.
This study introduces the SAFIA (Suspension Array Fluorescence Immunoassay), a particle-based immunoassay utilizing fluorescence-encoded microparticles for the simultaneous detection of multiple analytes [6, 7]. The assay's innovative advancement comes with the inclusion of ergot alkaloids, a novel addition to its existing detection capabilities for fusarium toxins and trichothecenes, thereby expanding its scope to a broader range of mycotoxins. The assay employs antibodies targeting the ergoline moiety common to all major ergot alkaloids, facilitated by a synthesized hapten mimicking the ergoline structure. This hapten was conjugated to amino-functionalized beads, and a panel of five monoclonal antibodies was evaluated for hapten recognition, binding specificity, and competitive binding efficiency.
Our findings demonstrate that all antibodies displayed similar affinities towards the hapten and lysergol (a stable and less hazardous analogue of lysergic acid used for calibration), achieving detection limits as low as 2 ppb. Cross-reactivity studies and analysis of round-robin test material indicated a significant underestimation of ergot alkaloid levels in samples. However, accurate detection of ergot alkaloids remains feasible through the application of a correction factor to the results, which compensates for this underestimation and ensures the assay's effectiveness. Despite this adjustment, the necessity for enhancements in antibody specificity to improve assay accuracy is evident. Furthermore, the inclusion of the ergot assay in a multiplexed setup for detecting FUM, DON, ZEN, and T-2 toxins showed no interference, although an unexpected inhibition among four out of five ergot antibodies was observed. This underscores the need for an improved immunogen structure to achieve optimal detection of ergot alkaloids.
In conclusion, our study presents a promising approach for the multiplexed detection of ergot alkaloids alongside other mycotoxins, highlighting the potential of SAFIA in enhancing food and feed safety through improved mycotoxin screening. Future work will focus on refining antibody specificity and assay configurations to overcome current limitations and ensure accurate, comprehensive mycotoxin detection.
Weitestgehendes Recycling vorhandener Materialien und Produkte ist ein wesentlicher Bestandteil der Kreislaufwirtschaft. Verpackungen auf Kunststoffbasis, darunter Behälter für Lebensmittel und Getränke, aber auch für die Lagerung und den Transport von Chemikalien und Gefahrgütern, werden derzeit größtenteils aus fossilen Rohstoffen hergestellt. Doch selbst für diese „kontaktempfindlichen“ Produkte besteht weiterhin das Ziel der Nachhaltigkeit durch den Einsatz von Recyclingmaterialien. Diese sehr aktuelle Diskussion findet derzeit im Rahmen der EU-Verpackungs- und Verpackungsabfallverordnung (PPWR) statt, die voraussichtlich noch in diesem Jahr abgeschlossen sein wird. Bei Verpackungen für den Transport gefährlicher Güter sind die Sicherheitseigenschaften der Behälter aus „neuen“ Materialien, einschließlich Polyethylen (PE), gut bekannt und werden im Rahmen ihrer Bauartzulassung getestet. Über ihre Gegenstücke aus Recyclingmaterialien ist jedoch weitaus weniger bekannt. Abgesehen von Materialschwächung kann der Eintrag von Rückständen in recycelte Kunststoffe zu einer Verunreinigung der Waren in der Verpackung führen.
Um diese Lücke zu schließen, haben wir Kanister aus hochdichtem PE (HDPE) aus Post-Consumer-Abfällen auf die Freisetzung von Kunststoffzusätzen und Verunreinigungen untersucht. Mithilfe eines umfassenden, nicht zielgerichteten Ansatzes mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) konnten wir je nach Art der gelagerten Chemikalie und Lagerdauer 895 verschiedene Komponenten detektieren. Die meisten Komponenten waren alleinig oder in wesentlich höherer Konzentration in recyceltem HDPE als in herkömmlichem HDPE nachzuweisen. 154 der Komponenten konnten identifiziert und auf ihre funktionale Verwendung hin analysiert werden. Interessanterweise ergab diese Analyse „Kosmetik“, „Duftstoffe“ und „Geschmacksstoffe“ als Hauptassoziationen neben bekannten und erwarteten Verwendungen im Bereich „Kunststoffe“. Dies deutete auf einen erheblichen Eintrag von Fremdverunreinigungen in das Produkt hin. Rezyklierte Kanister zeigten damit deutliche Nachteile im Vergleich zu herkömmlichen Kanistern. Eine detaillierte Bewertung der Ergebnisse im Hinblick auf die Materialsicherheit in diesem Produktsegment steht noch aus.
Therapeutic monoclonal antibodies are the fastest-growing class of biological agents and the development of reliable analytical methods for their quantification is becoming increasingly important. Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) represents one of the leading technologies for antibody quantification. The serin protease trypsin has emerged as the gold standard enzyme for digesting intact protein into peptides for this approach. However, many protocols exist that often lead to different results. The talk will provide a brief introduction to the application of novel thermostable and surface-functionalized trypsin particles for improved antibody digestion as well as initial successes in polymer functionalization of the corundum surface to prevent nonspecific protein adsorption during the digestion procedure.
Die Erforschung des Proteoms, der Gesamtheit der Proteine eines Lebewesens, ist von großer Bedeutung für das Verständnis biologischer Systeme. Aufgrund dessen ist die Proteomik ist eines der bedeutendsten aktuellen Forschungsfelder der Biowissenschaften. In der Bottom-Up-Proteomik werden die Proteine einer Probe vor ihrer Analyse einem enzymatischen Verdau mit Proteasen unterzogen, was eine erleichterte Analyse mit hohem Durchsatz ermöglicht. Aufgrund seiner hohen Aktivität und Effektivität hat sich die Serinprotease Trypsin als Standard-Enzym der Proteomik etabliert. Die weitere Verbesserung ihrer Enzymcharakteristika, wie Thermostabilität und Aktivität, ist unter anderem durch Immobilisierung an ein Trägermaterial oder genetische Modifikation möglich. In der vorliegenden Arbeit wurde eine von Xiao et al. 2023 entwickelte thermostabile Trypsin-Variante mit erhöhter Oberflächen-Hydrophobizität rekombinant in E. coli hergestellt und sowohl immobilisiert als auch in Lösung hinsichtlich ihrer Enzymaktivität und Thermostabilität im Vergleich zum Wildtyp charakterisiert. Die vorliegende Arbeit stellt dabei eine Erstbeschreibung der Immobilisierung einer thermostabilen Trypsin-Spezies an ein Trägermaterial dar und untersucht somit erstmalig das Zusammenspiel der beiden Optimierungsstrategien Immobilisierung und genetische Modifikation.
Das thermostabile Trypsin und sein Wildtyp wurden rekombinant als Zymogene hergestellt, wobei trotz verschiedener Strategien zum Erhalt der nativen Konformation, wie der Fusion mit dem Chaperon-ähnlichen Maltose-bindenden Protein (MBP), eine starke Aggregation in Einschlusskörperchen (inclusion bodies, IB) erfolgte. Im Zuge der Rückfaltung der fehlgefalteten Proteine wurden verschiedene Rückfaltungsbedingungen untersucht, wobei die Vorteile einer langsamen Absenkung des Gehalts der Denaturierungsreagenz in Kombination mit einem Cystein-Cystine- Redoxsystem dargelegt werden konnten. Es konnte keine Verbesserung der Aktivität und Thermostabilität des genetisch modifizierten Enzyms in freier Form festgestellt werden, jedoch eine erhöhte Substrataffinität. Durch Immobilisierung an Magnetbeads mit tosylfunktionalisierter Oberfläche konnte die Enzymaktivität der genetisch modifizierten Trypsin-Variante bei 80 °C vollständig erhalten werden, während die Aktivität des Wildtyps verringert wurde. Dies legt nahe, dass die erhöhte Oberflächen-Hydrophobizität der modifizierten Trypsin-Variante zu einer erhöhten Bindung an das Trägermaterial beiträgt, was eine Verbesserung der Stabilität bei thermischer Erhitzung bewirkt.
Non‐targeted screenings (NTS) are essential tools in different fields, such as forensics, health and environmental sciences. NTSs often employ mass spectrometry (MS) methods due to their high throughput and sensitivity in comparison to, for example, nuclear magnetic resonance–based methods. As the identification of mass spectral signals, called annotation, is labour intensive, it has been used for developing supporting tools based on machine learning (ML). However, both the diversity of mass spectral signals and the sheer quantity of different ML tools developed for compound annotation present a challenge for researchers in maintaining a comprehensive overview of the field.In this work, we illustrate which ML‐based methods are available for compound annotation in non‐targeted MS experiments and provide a nuanced comparison of the ML models used in MS data analysis, unravelling their unique features and performance metrics. Through this overview we support researchers to judiciously apply these tools in their daily research. This review also offers a detailed exploration of methods and datasets to show gaps in current methods, and promising target areas, offering a starting point for developers intending to improve existing methodologies.
The non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) diclofenac (DCF) is an important environmental contaminant occurring in surface waters all over the world, because, after excretion, it is not adequately removed from wastewater in sewage treatment plants. To be able to monitor this pollutant, highly efficient analytical methods are needed, including immunoassays. In a medical research project, monoclonal antibodies against diclofenac and its metabolites had been produced. Based on this monoclonal anti-DCF antibody, a new indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed and applied for environmental samples. The introduction of a spacer between diclofenac and the carrier protein in the coating conjugate led to higher sensitivity. With a test midpoint of 3 mg L−1 and a measurement range of 1–30 mg L−1, the system is not sensitive enough for direct analysis of surface water. However, this assay is quite robust against matrix influences and can be used for wastewater. Without adjustment of the calibration, organic solvents up to 5%, natural organic matter (NOM) up to 10 mg L−1, humic acids up to 2.5 mg L−1, and salt concentrations up to 6 g L−1 NaCl and 75 mg L−1 CaCl2 are tolerated. The antibody is also stable in a pH range from 3 to 12. Cross-reactivity (CR) of 1% or less was determined for the metabolites 40-hydroxydiclofenac (40-OH-DCF), 5-hydroxydiclofenac (5-OH-DCF), DCF lactam, and other NSAIDs. Relevant cross-reactivity occurred only with an amide derivative of DCF, 6-aminohexanoic acid (DCF-Ahx), aceclofenac (ACF) and DCF methyl ester (DCF-Me) with 150%, 61% and 44%, respectively. These substances, however, have not been found in samples. Only DCF-acyl glucuronide with a cross-reactivity of 57% is of some relevance. For the first time, photodegradation products were tested for cross-reactivity. With the ELISA based on this antibody, water samples were analysed. In sewage treatment plant effluents, concentrations in the range of 1.9–5.2 mg L−1 were determined directly, with recoveries compared to HPLC-MS/MS averaging 136%.
Concentrations in lakes ranged from 3 to 4.4 ng L−1 and were, after pre-concentration, determined with an average recovery of 100%
Therapeutic monoclonal antibodies are the fastest-growing group of biological agents which generated a yearly turnover of USD 210 billion in 2022 and whose sales are expected to grow by 10% annually over the next 10 years. With steadily increasing market importance, analytical methods for reliable quantification of therapeutic antibodies also become more and more relevant. Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) has become the main technology for antibody quantification. This approach, however, requires enzymatic digestion of the intact protein into peptides, for which a wide range of different protocols exists that often lead to different results depending on the digestion procedure or trypsin variants used. In particular, the amount and type of detergents added for protein unfolding prior to digestion is known to create significant bias in measurement results. The overall goal of the presented project is the application of novel thermostable and surface-functionalized trypsin particles for improved antibody digestion. Specifically, a trypsin-variant described in the literature exhibiting increased activity and thermal stability above 80°C, will be examined. The application of this enzyme should allow to perform digestion at elevated temperatures where the protein is naturally unfolding thereby increasing enzyme accessibility without the need for detergents. Furthermore, we will immobilize the thermostable trypsin onto the surface to further enhance enzyme stability, prevent self-digestion, and enable separation of trypsin from target peptides before LC–MS/MS analysis. As an immobilization platform, cheap and non-porous corundum particles will be used as these show high chemical stability and low levels of interaction of matrix proteins with the functionalized surface. adsorption. In a multidisciplinary collaboration with the SALSA Photonics Lab, we will investigate the characteristics of covalent enzyme binding and unspecific peptide binding using an interface-sensitive analytical tool, vibrational sum-frequency generation (VSFG) spectroscopy. The insights gained will not only lead to new competencies in peptide and enzyme surface analysis using VSFG spectroscopy in SALSA but will also significantly contribute to optimizing antibody quantification.
Antikörper sind in der medizinischen Welt nicht mehr wegzudenken. Ihr Einsatz-Repertoire als Therapeutika für die Behandlung diverser Krankheiten und Infektionen weitet sich von Jahr zu Jahr mehr aus. Dabei basiert ein Großteil der verwendeten Antikörper zu diesem Zeitpunkt auf monoklonalen Antikörpern auf Basis von Hybridomazellen. Doch hier könnten rekombinante Antikörper aufgrund ihrer Vektor-basierten Expression eine vielversprechende und womöglich sogar revolutionierende Alternative bieten. So ergeben sich neue Optimierungsoptionen für Merkmale wie Affinität, Stabilität und Kompatibilität über Anpassungen auf genetischer oder posttranslationaler Ebene. Allerdings ergibt sich kein Anwendungszweck ohne die vorhergehende detaillierte Charakterisierung der Antikörper. Denn nur mit spezifischem Wissen über die diversen Eigenschaften und Wechselwirkungen kann eine effektive und präzise Verwendung in der Diagnostik und Therapeutik gewährleistet werden und auf diese Weise Leben retten.
Aus diesem Grund beschäftigt sich diese Masterarbeit mit der Vertiefung der rekombinanten Antikörper-Thematik. Dazu soll ein Anti-Tetanus-Antikörper erstmals rekombinant in verschiedenen Zelllinien hergestellt und anschließend über umfangreiche analytische Verfahren mit einem Fokus auf die Einflussanalyse der unterschiedlichen posttranslationalen Glykosylierungen charakterisiert werden. Zu diesem Zweck wurden als Grundlage einerseits zwei P1316-Dual-Expressions-Vektoren mit variierenden Insert-Positionen der schweren und leichten Kette durch Gibson-Assembly sowie individuellen pRK5-Plasmide für eine separiert Expression der Antikkörperketten mithilfe Restriktionsfragment-Ligation generiert. In einer Gegenüberstellung der der Expressionsausbeuten stellte sich die Überlegenheit der P1316-Plasmid-Konfiguration heraus, in der das Leichtketten-Insert an der ersten Expressionsstelle positioniert ist. Deshalb wurde dieser Vektor als Ausgangspunkt für die anschließende hochskalierten Herstellung des Anti-Tetanus-Antikörpers in Expi293F-GnTI- und ExpiCHO-S-Zellen verwendet. Ein ELISA bestätigte die Bindungsaktivität der rekombinanten Antikörper am Tetanus-Toxoid unabhängig vom Expressionssystem. Nach einer folgenden Optimierung der für die Aufreinigung verwendeten Protein-A-Affinitätschromatographie, wurde über weitere Charakterisierungsmethoden wie Größenausschlusschromatographie und dynamische Lichtstreuung eine vergleichbare Aggregation aufgrund der sauren Elution aufgezeigt. In diesem Kontext wurde die Notwendigkeit einer Zweistufen-Präparation mit Affinitäts- und Größenausschlusschromatografie für den Erhalt monodisperser Proben verdeutlicht. Zudem wurden die verschiedenen intakten Massen mitsamt ihrer spezifischen Glykan-abhängigen Streumaßen in Relation zum monoklonalen NISTmAB-Referenzantikörper bestimmt. Dabei konnte den Erwartungen nach sowohl die geringere Masse als auch die uniformere Glykosylierung der in Expi293 GnTI- exprimierten Immunoglobuline in Relation zum ExpiCHO-S-Antikörper nachgewiesen werden. Anschließend wurde das Stabilitätsverhalten mittels thermischer Entfaltung und dynamischer Lichtstreuung über einen ausgeweiteten Zeitraum sowie verschiedenen Temperaturen dokumentiert. Grundlegend wurde eine höhere thermische Stabilität der zweiten konstanten Schwerketten-Domäne des aus ExpiCHO-S-Zellen stammenden Antikörpers nachgewiesen. Außerdem konnte eine problemlose Lagerungsfähigkeit beider unterschiedlich glykosylierter Antikörper bei Raumtemperatur für mindestens 4 Wochen festgestellt werden. Des Weiteren wurde die Langzeitlagerung im Rahmen der Auswirkung von Gefrier-Auftau-Zyklen mit gleichbleibenden Methoden sowie zusätzlicher Größenausschlusschromatographie erprobt. Hierbei stellte sich der Erhalt der strukturellen Integrität nach bis zu 15 Zyklen heraus. Allerdings geht die Monodispersität bereits nach wenigen Zyklen verloren, wobei die geringfügiger glykosylierten Expi293F-GnTI-Anti-Tetanus-Antikörper eine stärkere Beeinträchtigung durch multiple Gefrier-Auftau-Zyklen aufwiesen.
Metabolomics
(2024)