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Quantifizierung der Schädigung von DNA in wässriger Lösung unter direkter Elektronenbestrahlung
(2018)
Bei der Behandlung von Krebs wird Strahlentherapie zur Zerstörung von Tumorzellen eingesetzt. Der zugrunde liegende Wirkmechanismus ist die durch ionisierende Strahlung verursachte Schädigung an Biomolekülen. Dabei kommt den Schädigungsprozessen an DNA aufgrund ihrer zentralen Rolle in Mutation und Zelltod eine besondere Bedeutung zu. Durch den hohen Wasseranteil in menschlichen Zellen findet ein Großteil der inelastischen Streuprozesse an Wassermolekülen statt und führt zur deren Radiolyse. Die so entstehenden Radiolyseprodukte sind für einen Großteil des Schadens an DNA verantwortlich. Ein detailliertes Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Interaktion ist die Voraussetzung um effizientere Therapien zu entwickeln.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Schädigung von DNA durch ionisierende Strahlung in Abhängigkeit der inelastischen Streuevents und des Energieeintrags innerhalb des biologisch relevanten mikroskopischen Treffervolumens zu quantifizieren. Die Bestrahlungen müssen dazu in Flüssigkeit, unter Berücksichtigung der chemischen Umgebung durchgeführt werden, welche die indirekten Schäden vermittelt. Deshalb wurde eine neuartige Kombination aus Experiment und Monte- Carlo-Simulationen entworfen und angewandt. Um Elektronenbestrahlung flüssiger Lösungen innerhalb eines Rasterelektronenmikroskops zu ermöglichen, wurde ein Probenhalter mit einer für Elektronen durchlässigen Nanomembran entwickelt. So können Bestrahlungen an DNA,
Proteinen, und Zellen bei verschiedenen pH-Werten, Salzkonzentrationen oder in Anwesenheit von Kosoluten durchgeführt werden. Für ein Modellsystem aus Plasmid-DNA in Wasser wurde damit die mittlere letale Dosis aus der Kombination der experimentellen Daten, Partikelstreusimulationen (Geant4-DNA) und Diffusionsberechnungen zu D1/2 = 1.7 ± 0.3 Gy bestimmt. Aus der Konvolution der Plasmidpositionen mit dem durch Elektronenstreusimulationen bestimmten ortsaufgelösten Energieeintrag wurde dessen Häufigkeitsverteilung im Targetvolumen der
Plasmide sowie der mittlere mikroskopische letale Energieeintrag berechnet als E1/2 = 6 ± 4 eV .
Es wurde gefolgert, dass weniger als zwei Ionisationsprozesse im sensitiven Targetvolumen der DNA im Mittel zu einem Einzelstrangbruch führen. Das für mikrodosimetrische Modellierungen wichtige Verhältnis von Einzelstrangbrüchen (SSB) zu Doppelstrangbrüchen (DSB) wurde als SSB : DSB = 12 : 1 bestimmt. Die vorgestellte Methode zur Bestimmung mikroskopischer Schaden-Dosis Relationen wurde auf weitere Klassen von Bestrahlungsexperimenten verallgemeinert. Dadurch ist die Methode unabhängig von der verwandten Primärstrahlung, der Probengeometrie und den Diffusionseigenschaften der untersuchten Moleküle anwendbar. So wird eine Vergleichbarkeit experimenteller Systeme mit inhomogenen Energieverteilungen erreicht, die bei ausschließlicher Betrachtung makroskopischer, gemittelter Größen nicht gegeben ist.
Des weiteren wurden die Strahlenschutzfunktionen des kompatiblen Soluts Ectoine und sein Einfluss auf Wasser und Biomoleküle untersucht. Mittels Ramanspektroskopie wurde ein kon-zentrationsabhängiger Anstieg des Anteils der Kollektivmoden des Wassers der OH-Streckschwingungen und dessen Unabhängigkeit von der Natriumchloridkonzentration beobachtet.
Molekulardynamik-Simulationen zeigten, dass die zwitterionischen Eigenschaften zur Bildung einer half-chair Konformation Ectoines führen. Die Wasserstoffbrückenbindungen in der ersten Hydrationshülle sind signifikant stabiler und besitzen höhere Lebensdauern als das Bulk-Wasser. Bestrahlung von DNA in Anwesenheit von 1 M Ectoine führt zu einer Erhöhung der Überlebensrate um den Faktor 1,41. Die Schutzfunktion wurde auf die Erhöhung des Streuquerschnitts niederenergetischer Elektronen an den akustischen Vibrationsmoden des Wasser durch Ectoine und seine Wirkung als OH-Radikalfänger zurückgeführt. Dies wurde mittels Ramanspektroskopie und Elektronenspinresonanzmessungen (ESR) nachgewiesen.
Das Ziel dieses Grundlagenforschungsprojektes war, die Abbaubarkeit syntheti-scher Polymere unter realitätsnahen Umweltbedingungen durch eine Mischung bzw. Blend eines Hydrolyse- mit einem Oxidations-empfindlichen Polymer zu verbessern, während er unter Nutzungsbedingungen stabil sein sollte. Die Arbeits-hypothese war, dass sich die Polymere gegenseitig in ihrem Abbau beschleunigen, wenn sie der alternierenden Wechselbeanspruchung aus UV-Strahlung und hydrolytischer Beanspruchung ausgesetzt sind. Hierfür wurden vier Blends aus Polylactid (PLA) und Polystyrol (PS) oder Polymethylmethacrylat (PMMA) in unterschiedlichen Mischverhältnissen und Phasenstrukturen mittels additiver Fertigung hergestellt. Die Blends wurden über acht Wochen bei 45 °C mittels alternierender Wechselbeanspruchung aus je fünf Tagen UV-Bestrahlung und zwei Tagen hydrolytischer Beanspruchung beschleunigt gealtert. Für eine Basis-charakterisierung und als Vergleichsgrundlage wurden zusätzlich die Ausgangs-polymere PLA, PS und PMMA jeweils einzeln der hydrolytischen Beanspruchung, UV-Beanspruchung und alternierenden Wechselbeanspruchung unterzogen. Neben der Bestimmung der physiko-chemischen Effekte auf Prüfkörperoberflächen und Bulk wurden erstmalig auch die Wassermedien auf Mikroplastikgehalte und ökotoxikologische Wirkungen analysiert.
Die Ergebnisse ergaben, dass reines PLA kaum degradierte, aber der PLA-Abbau sowohl durch Mischung mit PS als auch PMMA verstärkt wurde. Entgegen der Hypothese wurde dadurch allerdings sowohl die Degradation von PS als auch von PMMA gehemmt. Es konnte gezeigt werden, dass sich PS und PMMA im Blend mit PLA durch radikalische Depolymerisation abbauten und die dabei entstehenden Radikale die PLA-Hydrolyse beschleunigten, was wiederum den Abbau der PS- und PMMA-Phasen verlangsamte. Die Ergebnisse zeigten, dass bei dem PLA/PS-Schichtblend (PLA/PS-50) der höchste PS-Gehalt von 50 % den stärksten Effekt auf den PLA-Abbau hatte. Insgesamt war allerdings selbst in diesem Fall die PLA-Degradation nach achtwöchiger Beanspruchung als gering einzustufen. Der totale Masseverlust von PLA/PS-50 entsprach nach achtwöchiger Wechselbeanspruchung -2,6 ± 0,2 mg absolut bzw. ca. -1,5 ± 0,1 % der Prüfkörpermasse, wovon 0,001 % in partikuläres Mikroplastik fragmentierte (PLA: 0,2 – 2,7 μg/g; PS: 3,0 – 3,4 μg/g). Folglich war der größte Teil des Masseverlustes der Prüfkörper auf die Bildung gelöster und/oder gasförmiger Degradationsprodukte zurückzuführen.
Ferner zeigten ökotoxikologische Untersuchungen der wechselbeanspruchten Wassermedien von PLA/PS-50 eine zunehmende Hemmung des Algenwachstums der Grünalge Desmodesmus subspicatus, die nach sechs Wochen Wechsel-beanspruchung zu 100 % Hemmung und nach acht Wochen zu einem Absterben der eingesetzten Algenzellen führte. Ergänzende Algenwachstumshemmungstests mit
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Prüfkörpern der Ausgangspolymere PLA und PS zeigten, dass dies nicht auf der Bildung von partikulärem Mikroplastik, sondern gelösten PS-Degradations-produkten basierte, wie z. B. Benzaldehyd oder Benzoesäure.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nur eine geringe Beschleunigung des PLA-Abbaus bei gleichzeitiger Hemmung des PS- bzw. PMMA-Abbaus stattfand - und das auch erst bei hohen PS- bzw. PMMA-Gehalten. Weiterführende Experimente zeigten, dass dies speziell für PS höchst bedenklich und nicht empfehlenswert ist, da es abhängig von der Konzentration der gelösten PS-Degradationsprodukte zu starken ökotoxikologischen Effekten kommen kann, die von der Hemmung des Algen-wachstums bis zum Algenabsterben reichen können. Folglich konnte die Arbeits-hypothese nur sehr eingeschränkt verifiziert werden und ist mit den hier untersuchten Polymeren als nicht zielführend einzuschätzen.