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Rekombinante Herstellung und explorative Anwendung immobilisierter, thermostabiler Trypsin-Varianten für die Bottom-Up-Proteomik

  • Die Erforschung des Proteoms, der Gesamtheit der Proteine eines Lebewesens, ist von großer Bedeutung für das Verständnis biologischer Systeme. Aufgrund dessen ist die Proteomik ist eines der bedeutendsten aktuellen Forschungsfelder der Biowissenschaften. In der Bottom-Up-Proteomik werden die Proteine einer Probe vor ihrer Analyse einem enzymatischen Verdau mit Proteasen unterzogen, was eine erleichterte Analyse mit hohem Durchsatz ermöglicht. Aufgrund seiner hohen Aktivität und Effektivität hat sich die Serinprotease Trypsin als Standard-Enzym der Proteomik etabliert. Die weitere Verbesserung ihrer Enzymcharakteristika, wie Thermostabilität und Aktivität, ist unter anderem durch Immobilisierung an ein Trägermaterial oder genetische Modifikation möglich. In der vorliegenden Arbeit wurde eine von Xiao et al. 2023 entwickelte thermostabile Trypsin-Variante mit erhöhter Oberflächen-Hydrophobizität rekombinant in E. coli hergestellt und sowohl immobilisiert als auch in Lösung hinsichtlichDie Erforschung des Proteoms, der Gesamtheit der Proteine eines Lebewesens, ist von großer Bedeutung für das Verständnis biologischer Systeme. Aufgrund dessen ist die Proteomik ist eines der bedeutendsten aktuellen Forschungsfelder der Biowissenschaften. In der Bottom-Up-Proteomik werden die Proteine einer Probe vor ihrer Analyse einem enzymatischen Verdau mit Proteasen unterzogen, was eine erleichterte Analyse mit hohem Durchsatz ermöglicht. Aufgrund seiner hohen Aktivität und Effektivität hat sich die Serinprotease Trypsin als Standard-Enzym der Proteomik etabliert. Die weitere Verbesserung ihrer Enzymcharakteristika, wie Thermostabilität und Aktivität, ist unter anderem durch Immobilisierung an ein Trägermaterial oder genetische Modifikation möglich. In der vorliegenden Arbeit wurde eine von Xiao et al. 2023 entwickelte thermostabile Trypsin-Variante mit erhöhter Oberflächen-Hydrophobizität rekombinant in E. coli hergestellt und sowohl immobilisiert als auch in Lösung hinsichtlich ihrer Enzymaktivität und Thermostabilität im Vergleich zum Wildtyp charakterisiert. Die vorliegende Arbeit stellt dabei eine Erstbeschreibung der Immobilisierung einer thermostabilen Trypsin-Spezies an ein Trägermaterial dar und untersucht somit erstmalig das Zusammenspiel der beiden Optimierungsstrategien Immobilisierung und genetische Modifikation. Das thermostabile Trypsin und sein Wildtyp wurden rekombinant als Zymogene hergestellt, wobei trotz verschiedener Strategien zum Erhalt der nativen Konformation, wie der Fusion mit dem Chaperon-ähnlichen Maltose-bindenden Protein (MBP), eine starke Aggregation in Einschlusskörperchen (inclusion bodies, IB) erfolgte. Im Zuge der Rückfaltung der fehlgefalteten Proteine wurden verschiedene Rückfaltungsbedingungen untersucht, wobei die Vorteile einer langsamen Absenkung des Gehalts der Denaturierungsreagenz in Kombination mit einem Cystein-Cystine- Redoxsystem dargelegt werden konnten. Es konnte keine Verbesserung der Aktivität und Thermostabilität des genetisch modifizierten Enzyms in freier Form festgestellt werden, jedoch eine erhöhte Substrataffinität. Durch Immobilisierung an Magnetbeads mit tosylfunktionalisierter Oberfläche konnte die Enzymaktivität der genetisch modifizierten Trypsin-Variante bei 80 °C vollständig erhalten werden, während die Aktivität des Wildtyps verringert wurde. Dies legt nahe, dass die erhöhte Oberflächen-Hydrophobizität der modifizierten Trypsin-Variante zu einer erhöhten Bindung an das Trägermaterial beiträgt, was eine Verbesserung der Stabilität bei thermischer Erhitzung bewirkt.zeige mehrzeige weniger

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Metadaten
Autor*innen:Birte S. Wulfes
Dokumenttyp:Sonstiges
Veröffentlichungsform:Graue Literatur
Sprache:Deutsch
Titel des übergeordneten Werkes (Deutsch):Masterarbeit
Jahr der Erstveröffentlichung:2024
Organisationseinheit der BAM:1 Analytische Chemie; Referenzmaterialien
1 Analytische Chemie; Referenzmaterialien / 1.8 Umweltanalytik
Gutachter*innen:Zoltán Konthur
Verlag:Technische Universität Berlin
Verlagsort:Berlin
Erste Seite:1
Letzte Seite:149
DDC-Klassifikation:Naturwissenschaften und Mathematik / Chemie / Analytische Chemie
Freie Schlagwörter:Immobilisierung; Proteomik; Rekombinante Proteine; Thermostabile Enzyme
Themenfelder/Aktivitätsfelder der BAM:Chemie und Prozesstechnik
Chemie und Prozesstechnik / Chemische Charakterisierung und Spurenanalytik
Verfügbarkeit des Dokuments:Datei im Netzwerk der BAM verfügbar ("Closed Access")
Datum der Freischaltung:02.09.2024
Referierte Publikation:Nein
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