TY - THES A1 - Hoffmann, Heike T1 - Untersuchungen zur Biozidauswirkung auf Bodenbakterien mit Hilfe von mikrobiologischen und molekularbiologischen Methoden N2 - Angemessene Methoden zur Überprüfung von Bakterienpopulationen im Boden sind für die toxikologische Bewertung von Chemikalien, Bioziden und schadstoffbelasteten Böden besonders wichtig, da sie Auskünfte über die biologische Wirksamkeit eines Stoffes auf Organismen geben. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand einerseits darin, molekularbiologische Methoden (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) zur Analyse mikrobieller Populationen für den Lebensraum Boden zu etablieren. Anderseits sollte die Charakterisierung und funktionelle Beschreibung der mikrobiellen Bodenpopulation unter Biozideinfluss in zwei unterschiedlichen Modellsystemen (in Flüssigkulturen und Bodensystem) erfolgen. Seit einiger Zeit erfolgt eine Wandlung in der Holzschutzmittel-anwendung von metallhaltigen zu organisch basierten Wirkstoffen. Der Austrag und die Auswirkung von zwei organischen Holzschutzmittel-komponenten (Tebuconazol und Benzalkoniumchlorid) aus dem Holz in den Boden wurde zunächst mit Hilfe von Kultivierungstechniken und chemischen Analysen untersucht. Durch Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) konnte eine Abschätzung über die Auswirkung der Biozide auf die Bodenbakterien gemacht werden. Die methodischen Einschränkungen und die Arbeitsintensität machte die Notwendigkeit für molekularbiologischer Methoden deutlich. Als zentrale molekularbiologische Methode wurde die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) angewendet. Das Potential dieser Methode wurde zum einen an einem Modellsystem in Flüssigkulturen ("in vitro") getestet und zum anderen durch Etablierung einer Extraktionsmethode als Vorschritt der FISH- Technik für Bodensysteme anwendbar gemacht. Um zu verifizieren, inwieweit Biozide (besonders Tebuconazol und Benzalkoniumchlorid) auf unterschiedliche Bakteriengruppen wirken, wurde ein Modellsystem "in vitro" entwickelt. Anhand von ausgewählten Bakterienarten konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe von FISH und einer "Färbe"- Methode (Live/Dead-Test) die Wirksamkeit der Biozide abgeschätzt werden kann. Es zeigte sich zum Beispiel, dass die Gram-Bakterien i.d.R. empfindlicher gegenüber Benzalkoniumchlorid waren als Gram-Bakterien. Die Untersuchungen an ausgewählten Reinkulturen und Mischkulturen erlaubten eine quantitative Abschätzung der Biozidauswirkungen und bieten ein Potential, Biozide vor ihrer Anwendung zu testen. Im Boden stören bzw. verhindern die Huminstoffe die Anwendung von FISH. Durch Etablierung einer Extraktionsmethode, bei der mit Hilfe von Polyvinylpyrrolidon (PVP) die Bakterienextrakte aufgereinigt werden, gelang es, die FISH-Technik auch für Bodensysteme anzuwenden. Es wurde ein zweites Modellsystem untersucht, bei dem die Populationänderung im Boden direkt durch FISH überprüft und gleichzeitig die Auswirkung der Biozide auf die Bodenfunktion anhand der Messung der Bodenatmung bestimmt wurde. Mit diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass bestimmte Bakteriengruppen bei toxischer Auswirkung von Tebuconazol und Benzalkoniumchlorid auf die Bodenatmung entweder prozentual im Boden zurückgingen (Gram-Bakterien mit niedrigen G+C- Gehalt durch Tebuconazolkontamination), oder andere Gruppen, einen gesteigerten Anteil in der Population zeigten (Proteobakterien der Subklasse Alpha und Gamma durch Benzalkoniumchlorid). Es war so möglich, durch FISH die Verteilung verschiedener phylogenetischer Gruppen mittels Einsatz spezifischer Oligonukleotidsonden im Boden zu untersuchen. Diese Untersuchungen sind geeignet, Bakterienarten mit möglichen hohen Abbaupotentialen zu finden. Anhand von verschiedenen Fallbeispielen von Verunreinigungen in Böden und Flüssigkulturen wurden die Möglichkeiten des Einsatzes von molekularbiologischen Methoden (besonders FISH) aufgezeigt. N2 - Suitable analysis techniques to detect bacterial communities are essential to assess the toxicity of chemical, biocides and polluted soil, because they can provide direct information about the biological efficacy of a specific compound on the organisms. The goal of the present thesis was firstly, to develop molecularbiological methods to investigate microbial population in soil ecosystems, and secondly to apply these methods for the characterization of microbial communities under biocide pollution. In recent times metal-based substances normally employed in wood preservation are being more commonly replaced by substances with an organic basis. The effluence and effect of two wood preserver compounds (tebuconazole, benzalconiumchloride) discharged from the wood into the soil was investigated using culture depending techniques and chemical analysis. By determination of colony forming units (cfu) one can estimate the effects of biocides on the soil bacteria. Due to methodical limitations and the level of work involved for such analysis, the necessity to develop molecular biological methods is evident. The fluorescence in situ hybridisation (FISH) was used as the basis for molecular biological investigations. On the one hand it was possible to test the potential of this method in a modellsystem („in vitro“), and on the other to apply it on soilsystems after establishing an extraction method as a first step before the FISH-technique. To verify how biocides (especially tebuconazole and benzalconiumchloride) effect different bacteria groups, the mode of action was tested in the model „in vitro“ system. By employing the FISH-technique and a „staining“- method (Live/Dead- test, moleculare probes, NL), the efficacy of the biocides could be estimated. It was shown that gram positive bacteria were more sensitive against benzalconiumchloride than gram negative bacteria. Investigations on these type of modellsystems with pure and mix cultures enable a quantitative evaluation of the biocides effectiveness, and provide a possibility for checking new biocides before application. In soil humic acid inhibit the application of FISH. An extraction method was established which functions by cleaning the bacterial extract with polyvinylpyrrolidone (PVP) and so it was possible to detect bacteria in soil with the FISH-technique. In a second modellsystem the changes of the population in the soil were investigated directly by FISH, while the soil function was controlled separately by measuring the soil respiration. In this examination it was shown, that under toxic influence to the soil respiration some bacteria groups decreased (gram positive bacteria with low G+C- Content under tebuconazole influence) in the soil, whereas other groups increased (Proteobacteria of the subclasses alpha and gamma under benzalconiumchloride influence). By using different case examples in this thesis, it was possible to demonstrate the detection of the different physiological groups with rRNA-targeting oligonucleotides in the soil. In this manner the potential of molecular biological techniques (in-particular FISH) for the analysis of impurities in soil was demonstrated. T3 - BAM Dissertationsreihe - 3 KW - Biozidauswirkung KW - mikrobiologischen und molekularbiologischen Methoden PY - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:b43-1550 SN - 978-3-86509-201-2 SN - 1613-4249 VL - 3 SP - 1 EP - 168 PB - Wirtschaftsverlag NW CY - Bremerhaven AN - OPUS4-155 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER -