TY - GEN A1 - Ecke, Alexander A1 - Bell, Jérémy A1 - Schneider, Rudolf T1 - From Laboratory Immunoassays to Immunosensors with an Integrated Microfluidic Flow System N2 - This research summary describe efforts to the development of a three-dimensional microfluidic flow cell for improved electrochemical substrate detection in HRP/TMB-based immunoassays. This work provides a valuable advancement in the sensitivity and integration of immunoassay technologies, aiding in the refinement of diagnostic tools. KW - Antikörper KW - Immunoassay KW - Microfluidics KW - Electrochemical detection KW - Biosensor PY - 2025 UR - https://www.elveflow.com/microfluidics-research-summaries/from-laboratory-immunoassays-to-immunosensors-with-an-integrated-microfluidic-flow-system/ SP - 1 EP - 4 CY - Paris AN - OPUS4-62674 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Schneider, Rudolf T1 - Wasserdiagnose durch die Verwendung von Markern N2 - Die Überwachung des gesamten Wasserkreislaufs auf Mikroverunreinigungen ist aus gesundheitlicher und ökologischer Hinsicht wünschenswert und gewinnt durch den Klimawandel und das zunehmende Erfordernis der Wiederverwendung des Brauchwassers weiter an Bedeutung. Die schnellen und kostengünstigen antikörperbasierten Methoden („Immunoassays“) können helfen, Informationslücken zu schließen und kürzere Reaktionszeiten zu ermöglichen. Von Labormethoden über tragbare Analysengeräte bis hin zu Online-Sensoren sind viele Formate möglich (u. a. ELISA, Abb. 1). Es muss zudem die Bereitstellung der notwendigen, hochqualitativen Antikörper gewährleistet werden. Da aber gilt „1 Analyt – 1 Antikörper“, ist die Herstellung eines Konsenses bezüglich der vordringlich zu bestimmenden Indikatoren/Marker notwendig. Auch die Normung der Verfahren ist parallel in Angriff zu nehmen. KW - Antikörper KW - Immunoassay KW - Abwasser KW - ELISA PY - 2025 UR - https://analyticalscience.wiley.com/content/article-do/wasserdiagnose-durch-die-verwendung-von-markern VL - 2025 IS - 1 SP - 1 EP - 4 PB - WILEY CY - Hoboken, NJ, USA AN - OPUS4-63508 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Resch-Genger, Ute A1 - Abram, Sarah-Luise A1 - Tavernaro, Isabella A1 - Zou, Shan A1 - Johnston, Linda T1 - Behind the Paper: Nanoscale Reference and Test Materials for the Validation of Characterization Methods for Engineered Nanomaterials – Current State, Limitations and Needs N2 - Engineered nanomaterials (NMs) of different material composition, morphology, and surface chemistry are widely used in material and life sciences. For NM quality control and risk assessment, NM key properties must be characterized with validated methods, requiring reference materials (RMs). KW - Engineered Nanomaterials KW - Nanoscale reference materials KW - Interlaboratory comparisons KW - Traceability KW - Standardization and Regulation KW - Nano KW - Particle KW - Quality assurance KW - Surface chemistry PY - 2025 UR - https://communities.springernature.com/posts/nanoscale-reference-and-test-materials-for-the-validation-of-characterization-methods-for-engineered-nanomaterials-current-state-limitations-and-needs SP - 1 EP - 3 PB - Springer Nature CY - Online AN - OPUS4-62572 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Resch-Genger, Ute A1 - Richter, Maria A1 - Güttler, Arne A1 - Pauli, Jutta A1 - Vogel, K. A1 - Homann, Christian A1 - Würth, Christian T1 - Extending Certified Spectral Fluorescence Standards for the Calibration and Performance Validation of Fluorescence Instruments to the NIR – Closing the Gap from 750 nm to 940 nm with Two Novel NIR Dyes N2 - Fluorescence methods provide spectral, intensity, polarization, and lifetime information, which contain sample- and instrument-specific contributions. Fluorescence data, comparable across instruments and laboratories, require validated calibration procedures and certified fluorescence standards. KW - Quality assurance KW - Reference material KW - Fluorescence KW - Dye KW - Traceability KW - Metrology KW - Calibration KW - Reference data KW - Reference product KW - Digital certificate KW - NIR KW - Instrument performance validation PY - 2025 SP - 1 EP - 4 PB - Springer Nature CY - London AN - OPUS4-62739 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Atanasova, Aleksandra T1 - Herstellung und Einsatz neuartiger Trypsin-Partikel für den enzymatischen Antikörper-Verdau N2 - In dieser Arbeit wurden zwei Trypsinvarianten, der Wildtyp (wtT) und eine thermostabile Variante (tsT), rekombinant hergestellt. Die Herstellung von Proteinen in Bakterien kann zu Fehlfaltungen und Einschlusskörperchen führen, weshalb eine geeignete Faltungsstrategie notwendig ist. In dieser Arbeit konnte eine schrittweise Vorgehensweise erfolgreich angewendet werden. Nach der Ni-NTA-Aufreinigung wurde zusätzlich eine substratspezifische Benzamidin-Aufreinigung eingesetzt, um die Aktivität zu verbessern. Außerdem wurden die rekombinanten Trypsine auf Korund immobilisiert. Korund ist ein kostengünstiges Material, das nach Silanisierung und Glutaraldehyd-Kopplung für die Bindung von Proteinen geeignet gemacht wurde. Dabei konnte gezeigt werden, dass mehr wtT als tsT gebunden wurde, was sich auch in den Kopplungsdichte widerspiegelte. Die immobilisierten Enzyme wurden in Bezug auf Aktivität, Wiederverwendbarkeit, Lagerfähigkeit und Temperaturstabilität untersucht. Beide Varianten zeigten vergleichbare Leistungen, wobei tsT bei höheren Temperaturen eine etwas bessere Stabilität aufwies. Für den Antikörperverdau wurden sowohl thermische als auch chemische Denaturierungen bei verschiedenen Temperaturen ( 37 °C und 60 °C) getestet. Die Analyse mit MALDI-TOF-MS zeigte, dass gute Werte für die Sequenzabdeckung erzielt werden konnten. Besonders die chemische Denaturierung führte zu besseren Ergebnissen mit weniger Selbstverdau. Beim Vergleich mit kommerziell immobilisiertem Crude-Trypsin zeigten die rekombinanten Varianten eine höhere Spezifität und bessere Sequenzabdeckung bei gleichzeitig geringerem Selbstverdau. Die Wiederverwendbarkeit wurde durch fünf Verdauzyklen bei 37 °C überprüft. Dabei blieb die Aktivität weitgehend stabil, auch wenn die Peakintensität in den MALDI-Spektren mit jedem Zyklus abnahm. Eine eindeutige Zuordnung der Fingerprints des Antikörpers aus einer Bibliothek von über 90 Antikörpern war trotz dessen gegeben. KW - Korund KW - Immobilisierung KW - Proteomik KW - Rekombinante Proteine KW - Thermostabile Enzyme PY - 2025 SP - 1 EP - 86 CY - Berlin AN - OPUS4-64433 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Wulfes, Birte S. T1 - Rekombinante Herstellung und explorative Anwendung immobilisierter, thermostabiler Trypsin-Varianten für die Bottom-Up-Proteomik N2 - Die Erforschung des Proteoms, der Gesamtheit der Proteine eines Lebewesens, ist von großer Bedeutung für das Verständnis biologischer Systeme. Aufgrund dessen ist die Proteomik ist eines der bedeutendsten aktuellen Forschungsfelder der Biowissenschaften. In der Bottom-Up-Proteomik werden die Proteine einer Probe vor ihrer Analyse einem enzymatischen Verdau mit Proteasen unterzogen, was eine erleichterte Analyse mit hohem Durchsatz ermöglicht. Aufgrund seiner hohen Aktivität und Effektivität hat sich die Serinprotease Trypsin als Standard-Enzym der Proteomik etabliert. Die weitere Verbesserung ihrer Enzymcharakteristika, wie Thermostabilität und Aktivität, ist unter anderem durch Immobilisierung an ein Trägermaterial oder genetische Modifikation möglich. In der vorliegenden Arbeit wurde eine von Xiao et al. 2023 entwickelte thermostabile Trypsin-Variante mit erhöhter Oberflächen-Hydrophobizität rekombinant in E. coli hergestellt und sowohl immobilisiert als auch in Lösung hinsichtlich ihrer Enzymaktivität und Thermostabilität im Vergleich zum Wildtyp charakterisiert. Die vorliegende Arbeit stellt dabei eine Erstbeschreibung der Immobilisierung einer thermostabilen Trypsin-Spezies an ein Trägermaterial dar und untersucht somit erstmalig das Zusammenspiel der beiden Optimierungsstrategien Immobilisierung und genetische Modifikation. Das thermostabile Trypsin und sein Wildtyp wurden rekombinant als Zymogene hergestellt, wobei trotz verschiedener Strategien zum Erhalt der nativen Konformation, wie der Fusion mit dem Chaperon-ähnlichen Maltose-bindenden Protein (MBP), eine starke Aggregation in Einschlusskörperchen (inclusion bodies, IB) erfolgte. Im Zuge der Rückfaltung der fehlgefalteten Proteine wurden verschiedene Rückfaltungsbedingungen untersucht, wobei die Vorteile einer langsamen Absenkung des Gehalts der Denaturierungsreagenz in Kombination mit einem Cystein-Cystine- Redoxsystem dargelegt werden konnten. Es konnte keine Verbesserung der Aktivität und Thermostabilität des genetisch modifizierten Enzyms in freier Form festgestellt werden, jedoch eine erhöhte Substrataffinität. Durch Immobilisierung an Magnetbeads mit tosylfunktionalisierter Oberfläche konnte die Enzymaktivität der genetisch modifizierten Trypsin-Variante bei 80 °C vollständig erhalten werden, während die Aktivität des Wildtyps verringert wurde. Dies legt nahe, dass die erhöhte Oberflächen-Hydrophobizität der modifizierten Trypsin-Variante zu einer erhöhten Bindung an das Trägermaterial beiträgt, was eine Verbesserung der Stabilität bei thermischer Erhitzung bewirkt. KW - Rekombinante Proteine KW - Proteomik KW - Thermostabile Enzyme KW - Immobilisierung PY - 2024 SP - 1 EP - 149 PB - Technische Universität Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-60885 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Schardt, Annika A1 - Schmitt, Johannes A1 - Engelhard, Carsten T1 - Cover image for the article "Single particle inductively coupled plasma mass spectrometry with nanosecond time resolution" N2 - Image for the front cover of the issue 39(2) of the JAAS (Journal of Analytical Atomic Spectrometry). See Annika Schardt et al., pp. 389–400. Image reproduced by permission of Annika Schardt, Johannes Schmitt and Carsten Engelhard. KW - Analytical chemistry KW - Nanoparticles KW - Single-particle characterization KW - Instrumentation KW - spICP-MS PY - 2024 DO - https://doi.org/10.1039/D4JA90005G SN - 1364-5544 SN - 0267-9477 VL - 39 IS - 2 SP - 295 PB - Royal Society of Chemistry (RSC) CY - Cambridge AN - OPUS4-62156 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Hiller, Lukas T1 - Herstellung und Charakterisierung eines rekombinanten Anti-Tetanus-Antikörpers aus verschiedenen Säugerzelllinien N2 - Antikörper sind in der medizinischen Welt nicht mehr wegzudenken. Ihr Einsatz-Repertoire als Therapeutika für die Behandlung diverser Krankheiten und Infektionen weitet sich von Jahr zu Jahr mehr aus. Dabei basiert ein Großteil der verwendeten Antikörper zu diesem Zeitpunkt auf monoklonalen Antikörpern auf Basis von Hybridomazellen. Doch hier könnten rekombinante Antikörper aufgrund ihrer Vektor-basierten Expression eine vielversprechende und womöglich sogar revolutionierende Alternative bieten. So ergeben sich neue Optimierungsoptionen für Merkmale wie Affinität, Stabilität und Kompatibilität über Anpassungen auf genetischer oder posttranslationaler Ebene. Allerdings ergibt sich kein Anwendungszweck ohne die vorhergehende detaillierte Charakterisierung der Antikörper. Denn nur mit spezifischem Wissen über die diversen Eigenschaften und Wechselwirkungen kann eine effektive und präzise Verwendung in der Diagnostik und Therapeutik gewährleistet werden und auf diese Weise Leben retten. Aus diesem Grund beschäftigt sich diese Masterarbeit mit der Vertiefung der rekombinanten Antikörper-Thematik. Dazu soll ein Anti-Tetanus-Antikörper erstmals rekombinant in verschiedenen Zelllinien hergestellt und anschließend über umfangreiche analytische Verfahren mit einem Fokus auf die Einflussanalyse der unterschiedlichen posttranslationalen Glykosylierungen charakterisiert werden. Zu diesem Zweck wurden als Grundlage einerseits zwei P1316-Dual-Expressions-Vektoren mit variierenden Insert-Positionen der schweren und leichten Kette durch Gibson-Assembly sowie individuellen pRK5-Plasmide für eine separiert Expression der Antikkörperketten mithilfe Restriktionsfragment-Ligation generiert. In einer Gegenüberstellung der der Expressionsausbeuten stellte sich die Überlegenheit der P1316-Plasmid-Konfiguration heraus, in der das Leichtketten-Insert an der ersten Expressionsstelle positioniert ist. Deshalb wurde dieser Vektor als Ausgangspunkt für die anschließende hochskalierten Herstellung des Anti-Tetanus-Antikörpers in Expi293F-GnTI- und ExpiCHO-S-Zellen verwendet. Ein ELISA bestätigte die Bindungsaktivität der rekombinanten Antikörper am Tetanus-Toxoid unabhängig vom Expressionssystem. Nach einer folgenden Optimierung der für die Aufreinigung verwendeten Protein-A-Affinitätschromatographie, wurde über weitere Charakterisierungsmethoden wie Größenausschlusschromatographie und dynamische Lichtstreuung eine vergleichbare Aggregation aufgrund der sauren Elution aufgezeigt. In diesem Kontext wurde die Notwendigkeit einer Zweistufen-Präparation mit Affinitäts- und Größenausschlusschromatografie für den Erhalt monodisperser Proben verdeutlicht. Zudem wurden die verschiedenen intakten Massen mitsamt ihrer spezifischen Glykan-abhängigen Streumaßen in Relation zum monoklonalen NISTmAB-Referenzantikörper bestimmt. Dabei konnte den Erwartungen nach sowohl die geringere Masse als auch die uniformere Glykosylierung der in Expi293 GnTI- exprimierten Immunoglobuline in Relation zum ExpiCHO-S-Antikörper nachgewiesen werden. Anschließend wurde das Stabilitätsverhalten mittels thermischer Entfaltung und dynamischer Lichtstreuung über einen ausgeweiteten Zeitraum sowie verschiedenen Temperaturen dokumentiert. Grundlegend wurde eine höhere thermische Stabilität der zweiten konstanten Schwerketten-Domäne des aus ExpiCHO-S-Zellen stammenden Antikörpers nachgewiesen. Außerdem konnte eine problemlose Lagerungsfähigkeit beider unterschiedlich glykosylierter Antikörper bei Raumtemperatur für mindestens 4 Wochen festgestellt werden. Des Weiteren wurde die Langzeitlagerung im Rahmen der Auswirkung von Gefrier-Auftau-Zyklen mit gleichbleibenden Methoden sowie zusätzlicher Größenausschlusschromatographie erprobt. Hierbei stellte sich der Erhalt der strukturellen Integrität nach bis zu 15 Zyklen heraus. Allerdings geht die Monodispersität bereits nach wenigen Zyklen verloren, wobei die geringfügiger glykosylierten Expi293F-GnTI-Anti-Tetanus-Antikörper eine stärkere Beeinträchtigung durch multiple Gefrier-Auftau-Zyklen aufwiesen. KW - Rekombinante Antikörper KW - Affinitätschromatographie KW - Größenausschlusschromatographie KW - MALDI-TOF-MS KW - Dynamische Lichtstreuung PY - 2024 SP - 1 EP - 120 CY - Berlin AN - OPUS4-59865 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Vergin, Chantal Celine T1 - Entwicklung eines Extraktionsverfahrens für Mykotoxine aus Lebensmitteln für die Messung in immunanalytischen Assays und Sensoren N2 - Mykotoxine sind sekundäre Stoffwechselprodukte, die von Schimmelpilzen gebildet werden. Sie sind unvermeidliche Lebensmittelkontaminanten und stellen daher ein ernstes Gesundheitsrisiko für Mensch und Tier dar. Aus diesem Grund hat die Europäische Kommission Vorschriften erlassen, die Höchstwerte für Mykotoxine in bestimmten Lebensmitteln vorsehen. Um die gesetzlichen Grenzwerte einzuhalten, müssen in der Lebensmittelindustrie Mykotoxinanalysen der eingehenden Waren durchgeführt werden. Gegenwärtig umfasst die Analyse zeitaufwändige Probenvorbereitungsschritte, denen in der Regel eine chromatographische Analyse folgt. Immunoassays ermöglichen eine Vor-Ort-Analyse, aber in der Regel sind für feste Lebensmittelproben lösungsmittelbasierte Extraktionsschritte erforderlich. Da Immunoassays in der Regel nicht mit den hohen Lösungsmittelkonzentrationen kompatibel sind, die üblicherweise für die Mykotoxinextraktion verwendet werden (z.B. Acetonitril oder Methanol), war es das Ziel dieser Arbeit, ein Extraktionsverfahren für die Mykotoxine Deoxynivalenol und Ochratoxin A aus Weizenmehl und Getreide zu entwickeln, das für Immunoassays und -sensoren verwendet werden kann. Vier verschiedene Lösungsmittel, Methanol (10 %), Ethanol (5 %) und Acetonitril (10 %) sowie Milli-Q-Wasser wurden für die Extraktion des Analyten Deoxynivalenol getestet. Um negative Umweltaspekte zu vermeiden und aufgrund der vergleichbaren Extraktionseffizienz von Milli-Q-Wasser gegenüber den anderen Lösungsmitteln, wurde Milli-Q-Wasser als Extraktionslösung im optimierten Extraktionsprotokoll für Deoxynivalenol verwendet. Es wurden verschiedene Extraktionsbedingungen, wie die Extraktionszeit, das Lösungsmittel-Feststoff-Verhältnis, der Filtrationsschritt, der Zentrifugationsschritt sowie die Zusammensetzung des Wassers untersucht. Auf der Grundlage der Ergebnisse wurde ein Extraktionsprotokoll festgelegt, mit dem Wiederfindungsraten in einem Bereich von x bis x erzielt wurden. Das Extraktionsprotokoll umfasste die Extraktion von 2 g Weizenmehl mit 40 ml Milli-Q-Wasser für 30 Minuten, die anschließende Zentrifugation bei 3000 U/min für 15 Minuten bei 4 °C und die Filtration des Überstands. KW - Mykotoxine KW - ELISA KW - Probenvorbereitung PY - 2023 SP - 1 EP - 81 CY - Berlin AN - OPUS4-59199 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Scholtz, Lena A1 - Resch-Genger, Ute T1 - Behind the Paper - Dual color pH probes made from silica and polystyrene nanoparticles and their performance in cell studies N2 - In this contribution we highlight the importance of comparison for scientific research while developing a new, functional pH sensor system, and the valuable insights this can provide. KW - Dye KW - Optical Spectroscopy KW - pH probe KW - Silica and Polystyrene Particles KW - Nano KW - Surface groups KW - Safe-by-Design KW - Cell studies KW - Sensors KW - Particle Synthesis KW - Fluorescence PY - 2023 UR - https://communities.springernature.com/posts/dual-color-ph-probes-made-from-silica-and-polystyrene-nanoparticles-and-their-performance-in-cell-studies SP - 1 EP - 2 PB - Springer Nature CY - London AN - OPUS4-59150 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER -