TY - GEN A1 - Hartfiel, Reni T1 - Zweistufiges Screening von One-Bead-One-Peptide-Bibliotheken linearer & cyclischer Peptide gegen Pflanzenviren N2 - In der Masterarbeit wurde ein Screening gegen den CCMV mit einer linearen Peptidbibliothek entwickelt, wobei zwei lineare Binder identifiziert wurden. Das resynthetisierte Peptid wurde auf seine Bindungseigenschaften mittels ELISA und MST untersucht. Aufgrund eines Aminosäurefehlers in der selbst durchgeführten Resynthese des Peptids sind die Ergebnisse nicht vollständig übertragbar. Um eine umsetzbare Cyclusgröße für die Peptidbibliothek zu finden, wurden Ringgrößen mit sechs bis acht Aminosäuren untersucht. Da keiner der gewählten Ringgrößen bevorzugt war, wurde die Ringgröße aus acht Aminosäuren für die Peptidbibliothek gewählt. Der Ringschluss wurde durch die Bildung einer Disulfidbrücke erreicht. Dadurch war die Alkylierung der vorhandenen Thiolgruppe in den Abbruchsequenzen notwendig. Neben den etablierten Alkylierungsreagenzien Iodessigsäure, Iodacetamid und Acrylamid wurden zwei Epoxide mituntersucht. Hierbei konnte nur bei Acrylamid und Propylenoxid eine vollständige Alkylierung beobachtet werden. Eine synthetische Peptidbibliothek aus zehn Aminosäuren pro Kopplungsschritt und einer Peptidlänge von acht Aminosäuren wurde erfolgreich nach der Split-and-Mix-Synthese hergestellt. Neben den kanonischen Aminosäuren wurde die synthetische Aminosäure 3-(3-Pyridyl)-alanin in die Peptidbibliothek mit eingebaut. Peptidsequenzen aus der cyclische Peptidbibliothek konnte mittels MALDI-TOF-MS identifiziert werden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass synthetische Aminosäuren mit proteinogenen Aminosäuren erfolgreich übersetzt werden. Anschließend wurde das entwickelte Screening auf eine cyclische Peptidbibliothek übertragen. Dabei konnte kein Binder identifiziert werden, da zu viele Nebenreaktionen auftraten. Ein alternativer Ringschluss über die Seitenketten von Lysin und Cystein wurden mit ortho-Phthaldialdehyd und 2,4,6-Trichloro-1,3,5-triazin (Cyanurchlorid) untersucht. Beide Bedingungen wiesen keinen erfolgreichen Ringschluss auf. Obwohl der Ringschluss über die Seitenketten von Lysin und Cystein nicht erfolgreich war, sollte ein Austausch von Cystein angestrebt werden, so dass kein freies Cystein in den Abbruchsequenzen vorhanden ist und die Alkylierung überflüssig wäre. Der Ringschluss durch Verwendung anderer Seitenketten bietet einen vielseitigen Ansatz. KW - CCMV KW - Pflanzenvirus KW - Peptidbibliothek KW - Peptid-Aptamer KW - Alkylierung KW - Cyclisierung KW - MALDI-TOF-MS KW - Fluoreszenz KW - Chip KW - Sequenzierung KW - Peptid-Synthese PY - 2022 SP - 1 EP - 81 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54501 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Döring, Sarah T1 - Vergleichende Darstellung SARS-CoV-2-spezifischer Nanobodys aus unterschiedlichen Wirtsorganismen N2 - Aufgrund der anhaltenden COVID-19-Pandemie werden neutralisierende Therapeutika benötigt. Eine Möglichkeit zur Behandlung stellt die Verwendung monoklonaler Anti-SARS-CoV-2-Immun-globuline dar. Ihre Produktion in Säugetierzellen ist jedoch schwer skalierbar, um den weltweiten Bedarf zu decken. VHH-Antikörper, auch Nanobodys genannt, bieten hierfür eine Alternative, da sie eine hohe Temperaturstabilität aufweisen und eine kostengünstige Produktion in prokaryotischen Wirtsorganismen ermöglichen. KW - E. coli KW - Corona KW - Virus KW - Spike-Protein KW - Nanobody KW - Antikörper KW - Expression KW - Fingerprint KW - Vhh KW - RBD KW - COVID-19 KW - SARS-CoV-2 KW - ELISA KW - MST KW - Halomonas elongata KW - Periplasma KW - SDS-PAGE KW - ACE2-Rezeptor PY - 2021 SP - 1 EP - 111 PB - Technische Universität Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54624 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Iwert, C. A1 - Stein, J. A1 - Appelt, C. A1 - Vogt, K. A1 - Rainer, R. J. A1 - Tummler, K. A1 - Mühle, K. A1 - Stanko, K. A1 - Schumann, J. A1 - Uebe, D. A1 - Jürchott, K. A1 - Lisec, Jan A1 - Janek, K. A1 - Gille, C. A1 - Textoris-Taube, K. A1 - Sai, S. A1 - Petersen, A. A1 - Kühl, A. A. A1 - Klipp, E. A1 - Meisel, C. A1 - Sawitzki, B. T1 - TCAIM controls effector T cell generation by preventing Mitochondria-Endoplasmic Reticulum Contact Site-initiated Cholesterol Biosynthesis N2 - T cells need to adapt their cellular metabolism for effector cell differentiation. This relies on alterations in mitochondrial physiology. Which signals and molecules regulate those alterations remains unclear. We recently reported, that the mitochondrial protein TCAIM inhibits activation-induced changes in mitochondrial morphology and function and thus, CD effector T cell formation. Using conditional TCAIM knock-in (KI) and knockout (KO) mice, w now show that it also applies to CD8+ T cells and more importantly, delineate the molecular processes in mitochondria by which TCAIM controls effector cell differentiation. TCAIM KI resulted in reduced activation-induced HIF1α protein expression. Metabolomics and transcriptional data in combination with mathematical flux modeling revealed an impaired induction of anabolic pathways, especially of the mevalonate pathway and cholesterol biosynthesis in TCAIM KI CD8+ T cells. Addition of cholesterol completely rescued HIF1α protein expression, activation and proliferation of TCAIM KI CD8+ T cells. At the molecular level, TCAIM delayed activation-induced mitochondria-ER contact (MERC) formation by binding to MERC promoting proteins such as RMD3 and VDAC2. In summary, we demonstrate that TCAIM suppresses effector cell differentiation by inhibiting MERC formation, which induce HIF1α-mediated increase in cellular metabolism and cholesterol biosynthesis. KW - Mass Spectroscopy KW - Metabolomics KW - Cancer PY - 2021 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-533543 UR - https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.20.440500v1 DO - https://doi.org/10.1101/2021.04.20.440500 VL - April SP - 1 EP - 45 PB - Cold Spring Harbor Laboratory AN - OPUS4-53354 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Fischer, Janina T1 - Suspensionsarray-Fluoreszenzimmunoassay zur Multiplexbestimmung von SARS-CoV-2-Antikörpern N2 - Übergeordnetes Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Optimierung eines Suspensionsarray-Fluoreszenzimmunoassays (SAFIA) für die simultane Bestimmung verschiedener gegen SARS-CoV-2-Proteine gerichtete Antikörper mittels Multiplexdetektion in komplexen Matrices wie humanen Blutserumproben. KW - SARS-CoV-2 KW - Corona KW - COVID-19 KW - Coronavirus KW - Virus KW - Spike-Protein KW - Nucleocapsid-Protein KW - RBD KW - SAFIA KW - LFIA KW - ELISA KW - Partikel KW - Mutationen KW - Neutralisierende Antikörper KW - Durchflusszytometrie KW - ACE2 PY - 2022 SP - 1 EP - 99 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54722 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Schwaar, Timm A1 - Remmler, Dario A1 - Börner, Hans G. T1 - Spec2Seq N2 - Spe2Seq automatically translates mass spectrometry fragment spectra of precision polymers into their corresponding sequence. This software is especially useful for combinatorial approaches. KW - Java GUI KW - Polymers KW - Mass spectroscopy (MS) PY - 2018 SP - 1 EP - 8 PB - Humboldt-Universität CY - Berlin AN - OPUS4-46987 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Vogl, Jochen T1 - Roadmap for the purity determination of pure metallic elements – Basic rinciples and helpful advice N2 - High purity materials can serve as a realisation of the Système International d’Unitès (SI) unit amount of substance for the specific element. Solutions prepared from such high purity materials using gravimetric preparation and the concept of molar mass are used as calibration solutions in many fields of analytical chemistry. Calibration solutions prepared this way provide the traceability to the SI and are the metrological basis in elemental analysis. The preparation and characterization of such primary pure substances, representing the realisation of the SI unit amount of substance, is undertaken only by a small number of National Metrology Institutes (NMI) and Designated Institutes (DI). Many other NMIs and DIs, however, prepare elemental calibration solutions as calibrants for their measurement services, such as the certification of matrix Reference Materials or the provision of reference values for Proficiency Testing schemes. The elemental calibration solutions used for this purpose are not a direct service to customers, such as preparing secondary calibration solutions, but provide the source of traceability for the other services. Hence, it is necessary for the NMI or DI to obtain data on the purity of the pure metals or other materials used to prepare the solutions with measurement uncertainties meeting the needs of the above described services. This is commonly undertaken as a “fit for purpose” assessment, appropriate for the uncertainty requirement of the service provided to customers. As a consequence, total purity measurements are a long-term strategy of CCQM-IAWG. Several studies were conducted (CCQM-P107, CCQM-K72 and CCQM-P149) on the measurement of the purity of zinc. From these studies, several conclusions can be drawn for the purity assessment of a pure (metallic) element. These conclusions will be put together in this document in order to assist all NMIs/DIs in performing a purity assessment, whenever needed. KW - Purity assessment KW - Metal assay approach KW - Impurity assessment approach KW - Traceability PY - 2018 UR - https://www.bipm.org/wg/CCQM/IAWG/Allowed/April_2017/CCQM-IAWG17-28.pdf.pdf SP - 1 EP - 9 CY - Sevre AN - OPUS4-46834 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Tchipilov, Teodor A1 - Raysyan, Anna A1 - Weller, Michael G. T1 - Methods for the quantification of particle-bound protein – Application to reagents for lateral-flow immunoassays (LFIA) N2 - Protein immobilization for the functionalization of particles is used in various applications, including biosensors, lateral-flow immunoassays (LFIA), bead-based assays, and others. Common methods for the quantification of bound protein are measuring protein in the supernatant before and after coating and calculating the difference. This popular approach has the potential for a significant overestimation of the amount of immobilized protein since layers not directly bound to the surface (soft protein corona) are usually lost during washing and handling. Only the layer directly bound to the surface (hard corona) can be used in subsequent assays. A simplified amino acid analysis method based on acidic hydrolysis and RP-HPLC-FLD of tyrosine and phenylalanine (aromatic amino acid analysis, AAAA) is proposed to directly quantify protein bound to the surface of gold nano- and latex microparticles. The results are compared with indirect methods such as colorimetric protein assays, such as Bradford, bicinchoninic acid (BCA), as well as AAAA of the supernatant. For both particle types, these indirect quantification techniques show a protein overestimation of up to 1700% compared to the direct AAAA measurements. In addition, protein coating on latex particles was performed both passively through adsorption and covalently through EDC/sulfo-NHS chemistry. Our results showed no difference between the immobilization methodologies. This finding suggests that usual protein determination methods are no unambiguous proof of a covalent conjugation on particles or beads. KW - Soft protein corona KW - Hard protein corona KW - Gold particles KW - Nanoparticles KW - Mikroparticles KW - Antibody KW - Bioconjugation KW - Protein quantification KW - Supernatant KW - Sodium chloride method KW - Covalent conjugation KW - Latex particles KW - Lateral flow immunoassays PY - 2022 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-545365 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202203.0332.v1 SP - 1 EP - 8 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-54536 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Tscheuschner, Georg A1 - Kaiser, Melanie N. A1 - Lisec, Jan A1 - Beslic, D. A1 - Muth, Thilo A1 - Krüger, M. A1 - Mages, H.-W. A1 - Dorner, B. G. A1 - Knospe, J. A1 - Schenk, J. A. A1 - Sellrie, F. A1 - Weller, Michael G. T1 - MALDI-TOF-MS-based identification of monoclonal murine anti-SARS-CoV-2 antibodies within one hour N2 - During the SARS-CoV-2 pandemic, many virus-binding monoclonal antibodies have been developed for clinical and diagnostic purposes. This underlines the importance of antibodies as universal bioanalytical reagents. However, little attention is given to the reproducibility crisis that scientific studies are still facing to date. In a recent study, not even half of all research antibodies mentioned in publications could be identified at all. This should spark more efforts in the search for practical solutions for the traceability of antibodies. For this purpose, we used thirty-five monoclonal antibodies against SARS-CoV-2 to demonstrate how sequence-independent antibody identification can be achieved by simple means applied onto the protein. First, we examined the intact and light chain masses of the antibodies relative to the reference material NIST-mAb 8671. Already half of the antibodies could be identified based solely on these two parameters. In addition, we developed two complementary peptide mass fingerprinting methods with MALDI-TOF-MS that can be performed in 45 minutes and had a combined sequence coverage of over 80%. One method is based on the partial acidic hydrolysis of the protein by 5 mM of sulfuric acid at 99 °C. Furthermore, we established a fast way for a tryptic digest without an alkylation step. We were able to show that the distinction of clones is possible simply by a brief visual comparison of the mass spectra. In this work, two clones originating from the same immunization gave the same fingerprints. Later, a hybridoma sequencing confirmed the sequence identity of these sister clones. In order to automate the spectral comparison for larger libraries of antibodies, we developed the online software ABID 2.0 (https://gets.shinyapps.io/ABID/). This open-source software determines the number of matching peptides in the fingerprint spectra. We propose that publications and other documents critically relying on monoclonal antibodies with unknown amino acid sequences should include at least one antibody fingerprint. By fingerprinting an antibody in question, its identity can be confirmed by comparison with a library spectrum at any time and context. KW - SARS-CoV-2 antibody KW - Reproducibility crisis KW - Peptide mass fingerprinting KW - Monoclonal antibody KW - Traceability KW - Antibody identification KW - Identity KW - Antibody light chain KW - MALDI-TOF-MS KW - Trypsin KW - Acidic cleavage KW - Antibody subclass KW - Database KW - Peak overlap KW - ABID KW - Sulfuric acid KW - Online software KW - Sequencing KW - Peptide coverage PY - 2022 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-545182 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202203.0229.v1 SN - 2310-287X SP - 1 EP - 24 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-54518 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Hiller, Lukas T1 - Herstellung und Charakterisierung eines rekombinanten Anti-Tetanus-Antikörpers aus verschiedenen Säugerzelllinien N2 - Antikörper sind in der medizinischen Welt nicht mehr wegzudenken. Ihr Einsatz-Repertoire als Therapeutika für die Behandlung diverser Krankheiten und Infektionen weitet sich von Jahr zu Jahr mehr aus. Dabei basiert ein Großteil der verwendeten Antikörper zu diesem Zeitpunkt auf monoklonalen Antikörpern auf Basis von Hybridomazellen. Doch hier könnten rekombinante Antikörper aufgrund ihrer Vektor-basierten Expression eine vielversprechende und womöglich sogar revolutionierende Alternative bieten. So ergeben sich neue Optimierungsoptionen für Merkmale wie Affinität, Stabilität und Kompatibilität über Anpassungen auf genetischer oder posttranslationaler Ebene. Allerdings ergibt sich kein Anwendungszweck ohne die vorhergehende detaillierte Charakterisierung der Antikörper. Denn nur mit spezifischem Wissen über die diversen Eigenschaften und Wechselwirkungen kann eine effektive und präzise Verwendung in der Diagnostik und Therapeutik gewährleistet werden und auf diese Weise Leben retten. Aus diesem Grund beschäftigt sich diese Masterarbeit mit der Vertiefung der rekombinanten Antikörper-Thematik. Dazu soll ein Anti-Tetanus-Antikörper erstmals rekombinant in verschiedenen Zelllinien hergestellt und anschließend über umfangreiche analytische Verfahren mit einem Fokus auf die Einflussanalyse der unterschiedlichen posttranslationalen Glykosylierungen charakterisiert werden. Zu diesem Zweck wurden als Grundlage einerseits zwei P1316-Dual-Expressions-Vektoren mit variierenden Insert-Positionen der schweren und leichten Kette durch Gibson-Assembly sowie individuellen pRK5-Plasmide für eine separiert Expression der Antikkörperketten mithilfe Restriktionsfragment-Ligation generiert. In einer Gegenüberstellung der der Expressionsausbeuten stellte sich die Überlegenheit der P1316-Plasmid-Konfiguration heraus, in der das Leichtketten-Insert an der ersten Expressionsstelle positioniert ist. Deshalb wurde dieser Vektor als Ausgangspunkt für die anschließende hochskalierten Herstellung des Anti-Tetanus-Antikörpers in Expi293F-GnTI- und ExpiCHO-S-Zellen verwendet. Ein ELISA bestätigte die Bindungsaktivität der rekombinanten Antikörper am Tetanus-Toxoid unabhängig vom Expressionssystem. Nach einer folgenden Optimierung der für die Aufreinigung verwendeten Protein-A-Affinitätschromatographie, wurde über weitere Charakterisierungsmethoden wie Größenausschlusschromatographie und dynamische Lichtstreuung eine vergleichbare Aggregation aufgrund der sauren Elution aufgezeigt. In diesem Kontext wurde die Notwendigkeit einer Zweistufen-Präparation mit Affinitäts- und Größenausschlusschromatografie für den Erhalt monodisperser Proben verdeutlicht. Zudem wurden die verschiedenen intakten Massen mitsamt ihrer spezifischen Glykan-abhängigen Streumaßen in Relation zum monoklonalen NISTmAB-Referenzantikörper bestimmt. Dabei konnte den Erwartungen nach sowohl die geringere Masse als auch die uniformere Glykosylierung der in Expi293 GnTI- exprimierten Immunoglobuline in Relation zum ExpiCHO-S-Antikörper nachgewiesen werden. Anschließend wurde das Stabilitätsverhalten mittels thermischer Entfaltung und dynamischer Lichtstreuung über einen ausgeweiteten Zeitraum sowie verschiedenen Temperaturen dokumentiert. Grundlegend wurde eine höhere thermische Stabilität der zweiten konstanten Schwerketten-Domäne des aus ExpiCHO-S-Zellen stammenden Antikörpers nachgewiesen. Außerdem konnte eine problemlose Lagerungsfähigkeit beider unterschiedlich glykosylierter Antikörper bei Raumtemperatur für mindestens 4 Wochen festgestellt werden. Des Weiteren wurde die Langzeitlagerung im Rahmen der Auswirkung von Gefrier-Auftau-Zyklen mit gleichbleibenden Methoden sowie zusätzlicher Größenausschlusschromatographie erprobt. Hierbei stellte sich der Erhalt der strukturellen Integrität nach bis zu 15 Zyklen heraus. Allerdings geht die Monodispersität bereits nach wenigen Zyklen verloren, wobei die geringfügiger glykosylierten Expi293F-GnTI-Anti-Tetanus-Antikörper eine stärkere Beeinträchtigung durch multiple Gefrier-Auftau-Zyklen aufwiesen. KW - Rekombinante Antikörper KW - Affinitätschromatographie KW - Größenausschlusschromatographie KW - MALDI-TOF-MS KW - Dynamische Lichtstreuung PY - 2024 SP - 1 EP - 120 CY - Berlin AN - OPUS4-59865 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Völzke, Jule Lexa T1 - Herstellung und Charakterisierung Antigen-beschichteter Nanopartikel als Analoga von Virus-like Particles (VLP) N2 - In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Nanomaterialien auf ihre Bindungsfähigkeit zu Proteinen untersucht. Zu Beginn standen dabei die Herstellung stabiler Dispersionen der einzelnen Nanopartikel und die Stabilität der gebildeten Konjugate im Vordergrund. Der Nachweis einer erfolgreichen Konjugatbildung, sprich der Beschichtung von Nanopartikel mit Proteinen, wurde sowohl qualitativ mittels DLS-Messungen als auch über quantitative Protein-Bestimmungen erbracht. Für die Quantifizierung konnten verschiedene Methoden eingesetzt werden. Neben der klassischen Vorgehensweise, welche indirekt über die Quantifizierung von ungebundenem Protein im Überstand erfolgt, konnten ihm Rahmen dieser Arbeit verschiedene direkte Bestimmungsmethoden entwickelt werden. So wurden mittels kolorimetrischer Tests, wie dem BCA-Assay und dem Bradford-Assay, Nanodiamantdispersionen mit Hilfe einer Korrekturwellenlänge vermessen und quantifiziert. Ebenso zum Einsatz kam die Methode der Aminosäureanalytik, welche aufgrund ihrer guten Rückführbarkeit auf Aminosäurestandards Ergebnisse mit hoher Richtigkeit generieren kann und ebenso die Detektion kleiner Proteinmengen möglich macht. Nach den erfolgten quantitativen Betrachtungen wurden die Protein-beschichteten Nanopartikel auf ihre Anwendbarkeit als Analoga von Virus-like Particles (VLP) bei einer Immunisierung zur Gewinnung von polyklonalen Antikörpern gegen humanes Ceruloplasmin in Kaninchen überprüft. Es konnte mittels ELISA gezeigt werden, dass die Konjugate erfolgreich für die Herstellung von Antikörpern eingesetzt werden können und im zeitlichen Verlauf einer Immunisierung eine Steigerung des Antikörper-Titers zu erreichen ist. KW - DLS KW - Dynamische Lichtstreuung KW - Aluminiumoxid KW - Nanodiamant KW - Gold-Nanopartikel KW - BSA KW - Albumin KW - Protein G KW - Ceruloplasmin KW - Immunpräzipitation KW - Ultraschall KW - BCA KW - Bradford-Assay KW - AAAA KW - Aromatische Aminosäureanalytik KW - ICP-MS KW - NaCl-Methode PY - 2018 SP - 1 EP - 107 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54625 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER -