TY - GEN A1 - Hartfiel, Reni T1 - Zweistufiges Screening von One-Bead-One-Peptide-Bibliotheken linearer & cyclischer Peptide gegen Pflanzenviren T2 - Masterarbeit N2 - In der Masterarbeit wurde ein Screening gegen den CCMV mit einer linearen Peptidbibliothek entwickelt, wobei zwei lineare Binder identifiziert wurden. Das resynthetisierte Peptid wurde auf seine Bindungseigenschaften mittels ELISA und MST untersucht. Aufgrund eines Aminosäurefehlers in der selbst durchgeführten Resynthese des Peptids sind die Ergebnisse nicht vollständig übertragbar. Um eine umsetzbare Cyclusgröße für die Peptidbibliothek zu finden, wurden Ringgrößen mit sechs bis acht Aminosäuren untersucht. Da keiner der gewählten Ringgrößen bevorzugt war, wurde die Ringgröße aus acht Aminosäuren für die Peptidbibliothek gewählt. Der Ringschluss wurde durch die Bildung einer Disulfidbrücke erreicht. Dadurch war die Alkylierung der vorhandenen Thiolgruppe in den Abbruchsequenzen notwendig. Neben den etablierten Alkylierungsreagenzien Iodessigsäure, Iodacetamid und Acrylamid wurden zwei Epoxide mituntersucht. Hierbei konnte nur bei Acrylamid und Propylenoxid eine vollständige Alkylierung beobachtet werden. Eine synthetische Peptidbibliothek aus zehn Aminosäuren pro Kopplungsschritt und einer Peptidlänge von acht Aminosäuren wurde erfolgreich nach der Split-and-Mix-Synthese hergestellt. Neben den kanonischen Aminosäuren wurde die synthetische Aminosäure 3-(3-Pyridyl)-alanin in die Peptidbibliothek mit eingebaut. Peptidsequenzen aus der cyclische Peptidbibliothek konnte mittels MALDI-TOF-MS identifiziert werden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass synthetische Aminosäuren mit proteinogenen Aminosäuren erfolgreich übersetzt werden. Anschließend wurde das entwickelte Screening auf eine cyclische Peptidbibliothek übertragen. Dabei konnte kein Binder identifiziert werden, da zu viele Nebenreaktionen auftraten. Ein alternativer Ringschluss über die Seitenketten von Lysin und Cystein wurden mit ortho-Phthaldialdehyd und 2,4,6-Trichloro-1,3,5-triazin (Cyanurchlorid) untersucht. Beide Bedingungen wiesen keinen erfolgreichen Ringschluss auf. Obwohl der Ringschluss über die Seitenketten von Lysin und Cystein nicht erfolgreich war, sollte ein Austausch von Cystein angestrebt werden, so dass kein freies Cystein in den Abbruchsequenzen vorhanden ist und die Alkylierung überflüssig wäre. Der Ringschluss durch Verwendung anderer Seitenketten bietet einen vielseitigen Ansatz. KW - CCMV KW - Pflanzenvirus KW - Peptidbibliothek KW - Peptid-Aptamer KW - Alkylierung KW - Cyclisierung KW - MALDI-TOF-MS KW - Fluoreszenz KW - Chip KW - Sequenzierung KW - Peptid-Synthese PY - 2022 SP - 1 EP - 81 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54501 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Döring, Sarah T1 - Vergleichende Darstellung SARS-CoV-2-spezifischer Nanobodys aus unterschiedlichen Wirtsorganismen T2 - Masterarbeit N2 - Aufgrund der anhaltenden COVID-19-Pandemie werden neutralisierende Therapeutika benötigt. Eine Möglichkeit zur Behandlung stellt die Verwendung monoklonaler Anti-SARS-CoV-2-Immun-globuline dar. Ihre Produktion in Säugetierzellen ist jedoch schwer skalierbar, um den weltweiten Bedarf zu decken. VHH-Antikörper, auch Nanobodys genannt, bieten hierfür eine Alternative, da sie eine hohe Temperaturstabilität aufweisen und eine kostengünstige Produktion in prokaryotischen Wirtsorganismen ermöglichen. KW - E. coli KW - Corona KW - Virus KW - Spike-Protein KW - Nanobody KW - Antikörper KW - Expression KW - Fingerprint KW - Vhh KW - RBD KW - COVID-19 KW - SARS-CoV-2 KW - ELISA KW - MST KW - Halomonas elongata KW - Periplasma KW - SDS-PAGE KW - ACE2-Rezeptor PY - 2021 SP - 1 EP - 111 PB - Technische Universität Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54624 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Weller, Michael G. T1 - The mystery of homochirality on earth T2 - Preprints N2 - Homochirality is an obvious feature of life on Earth. On the other hand, extraterrestrial samples contain largely racemic compounds. The same is true for any common organic synthesis. Therefore, it has been a perplexing puzzle for decades how these racemates could have formed enantiomerically enriched fractions as a basis for the origin of homochiral life forms. Numerous hypotheses have been put forward as to how preferentially homochiral molecules could have formed and accumulated on Earth. In this article, it is shown that homochirality of the abiotic organic pool at the time of formation of the first self-replicating molecules is not necessary and not even probable. It is proposed to abandon the notion of a molecular ensemble and to focus on the level of individual molecules. Although the formation of the first self-replicating, most likely homochiral molecule is a seemingly improbable event, on a closer look, it is almost inevitable that homochiral molecules have formed simply on a statistical basis. In this case, the non-selective leap to homochirality would be one of the first steps in chemical evolution directly out of a racemic “ocean”. Moreover, most studies focus on the chirality of the primordial monomers with respect to an asymmetric carbon atom. However, any polymer with a minimal size that allows folding to a secondary structure, would spontaneously lead to asymmetric higher structures (conformations). Most of the functions of these polymers would be influenced by this inherently asymmetric folding. To summarize, simple and universal mechanisms may have led to homochiral self-replicating systems in the context of chemical evolution. A homochiral monomer pool is deemed unnecessary and probably never existed on primordial Earth. N2 - Homochiralität ist ein offenkundiges Merkmal des Lebens auf der Erde. Andererseits enthalten extraterrestrische Proben überwiegend racemische Verbindungen. Das Gleiche gilt für jede gängige organische Synthese. Daher war es seit Jahrzehnten ein Rätsel, wie diese Racemate enantiomerenangereicherte Fraktionen als Grundlage für den Ursprung homochiraler Lebensformen bilden konnten. Es wurden zahlreiche Hypothesen darüber formuliert, wie sich bevorzugt homochirale Moleküle auf der Erde gebildet und angereichert haben könnten. In diesem Artikel wird gezeigt, dass die Homochiralität des abiotischen organischen Pools zum Zeitpunkt der Bildung der ersten selbstreplizierenden Moleküle nicht notwendig und nicht einmal wahrscheinlich ist. Es wird vorgeschlagen, die Vorstellung eines molekularen Ensembles aufzugeben und sich auf die Ebene der einzelnen Moleküle zu konzentrieren. Obwohl die Bildung des ersten selbstreplizierenden, vermutlich homochiralen Moleküls ein scheinbar unwahrscheinliches Ereignis ist, ist es bei näherer Betrachtung fast unvermeidlich, dass sich homochirale Moleküle einfach auf statistischer Basis gebildet haben. In diesem Fall wäre der nicht-selektive Sprung zur Homochiralität einer der ersten Schritte der chemischen Evolution direkt aus einem racemischen "Ozean" heraus. Außerdem konzentrieren sich die meisten Studien auf die Chiralität der ursprünglichen Monomere in Bezug auf ein asymmetrisches Kohlenstoffatom. Jedes Polymer mit einer Mindestgröße, die eine Faltung zu einer Sekundärstruktur ermöglicht, würde jedoch spontan zu asymmetrischen höheren Strukturen (Konformationen) führen. Die meisten Funktionen dieser Polymere würden durch diese inhärent asymmetrische Faltung beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass einfache und universelle Mechanismen zu homochiralen selbstreplizierenden Systemen im Rahmen der chemischen Evolution geführt haben könnten. Ein homochiraler Monomerpool wird als unnötig erachtet und hat daher wahrscheinlich auf der Urerde auch nie existiert. KW - Chemical evolution KW - Abiogenesis KW - Chirality KW - Amino acids KW - Peptides KW - Folding chirality PY - 2024 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-598462 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202401.1939.v1 SN - 2310-287X VL - 14 IS - 3 SP - 1 EP - 12 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-59846 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Fischer, Janina T1 - Suspensionsarray-Fluoreszenzimmunoassay zur Multiplexbestimmung von SARS-CoV-2-Antikörpern T2 - Masterarbeit N2 - Übergeordnetes Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Optimierung eines Suspensionsarray-Fluoreszenzimmunoassays (SAFIA) für die simultane Bestimmung verschiedener gegen SARS-CoV-2-Proteine gerichtete Antikörper mittels Multiplexdetektion in komplexen Matrices wie humanen Blutserumproben. KW - SARS-CoV-2 KW - Corona KW - COVID-19 KW - Coronavirus KW - Virus KW - Spike-Protein KW - Nucleocapsid-Protein KW - RBD KW - SAFIA KW - LFIA KW - ELISA KW - Partikel KW - Mutationen KW - Neutralisierende Antikörper KW - Durchflusszytometrie KW - ACE2 PY - 2022 SP - 1 EP - 99 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54722 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Schwaar, Timm A1 - Remmler, Dario A1 - Börner, Hans G. T1 - Spec2Seq T2 - edoc-Server: Open-Access-Publikationsserver der Humboldt-Universität N2 - Spe2Seq automatically translates mass spectrometry fragment spectra of precision polymers into their corresponding sequence. This software is especially useful for combinatorial approaches. KW - Java GUI KW - Polymers KW - Mass spectroscopy (MS) PY - 2018 SP - 1 EP - 8 PB - Humboldt-Universität CY - Berlin AN - OPUS4-46987 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Wilke, Marco A1 - Röder, Bettina A1 - Paul, Martin A1 - Weller, Michael G. T1 - Sintered Glass Monoliths as New Supports for Affinity Columns T2 - Preprints N2 - A novel stationary phase for affinity separations is presented. This material is based on sintered borosilicate glass readily available as semi-finished filter plates with defined porosity and surface area. The material shows fast binding kinetics and excellent long-term stability under real application conditions due to lacking macropores and high mechanical rigidity. The glass surface can be easily modified with standard organosilane chemistry to immobilize selective binders or other molecules used for biointeraction. In this paper, the manufacturing of the columns and their respective column holders by 3D printing is shown in detail. The model system protein A/IgG was chosen as an example to examine the properties of such monolithic columns under realistic application conditions. Several specifications, such as (dynamic) IgG capacity, pressure stability, long-term performance, productivity, non-specific binding, and peak shape, are presented. It could be shown that due to the very high separation speed, 250 mg antibody per hour and column can be collected, which surpasses the productivity of most standard columns of the same size. The total IgG capacity of the shown columns is around 4 mg (5.5 mg/mL), which is sufficient for most tasks in research laboratories. The cycle time of an IgG separation can be less than 1 minute. Due to the glass material's excellent pressure resistance, these columns are compatible with standard HPLC systems. This is usually not the case with standard affinity columns, limited to manual use or application in low-pressure systems. The use of a standard HPLC system also improves the ability for automation, which enables the purification of hundreds of cell supernatants in one day. The sharp peak shape of the elution leads to an enrichment effect, which might increase the concentration of IgG by a factor of 3. The final concentration of IgG can be around 7.5 mg/mL without the need for an additional nanofiltration step. The purity of the IgG was > 95% in one step and nearly 99% with a second polishing run. KW - Affinity Chromatography KW - Glass KW - Purification KW - Antibodies KW - Solid support KW - HPLC KW - FPLC KW - Separation PY - 2021 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-529117 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202103.0298.v1 SP - 1 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-52911 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Steglich, P. A1 - Rabus, D. G. A1 - Sada, C. A1 - Paul, Martin A1 - Weller, Michael G. A1 - Mai, C. A1 - Mai, A. T1 - Silicon Photonic Micro-Ring Resonators for Chemical and Biological Sensing: A Tutorial T2 - TechRixv N2 - Silicon photonic micro-ring resonators (MRR) developed on the silicon-on-insulator (SOI) platform, owing to their high sensitivity and small footprint, show great potential for many chemical and biological sensing applications such as label-free detection in environmental monitoring, biomedical engineering, and food analysis. In this tutorial, we provide the theoretical background and give design guidelines for SOI-based MRR as well as examples of surface functionalization procedures for label-free detection of molecules. After introducing the advantages and perspectives of MRR, fundamentals of MRR are described in detail, followed by an introduction to the fabrication methods, which are based on a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) technology. Optimization of MRR for chemical and biological sensing is provided, with special emphasis on the optimization of waveguide geometry. At this point, the difference between chemical bulk sensing and label-free surface sensing is explained, and definitions like waveguide sensitivity, ring sensitivity, overall sensitivity as well as the limit of detection (LoD) of MRR are introduced. Further, we show and explain chemical bulk sensing of sodium chloride (NaCl) in water and provide a recipe for label-free surface sensing. KW - Lab on a chip KW - Biosensor KW - Cmos KW - Silanization KW - Surface derivatization KW - Evanescent wave PY - 2021 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-529360 DO - https://doi.org/10.36227/techrxiv.14909901.v1 SP - 1 EP - 18 PB - IEEE CY - Piscataway Township AN - OPUS4-52936 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Tchipilov, Teodor A1 - Meyer, Klas A1 - Weller, Michael G. T1 - Quantitative 1H Nuclear Magnetic Resonance (qNMR) of Aromatic Amino Acids for Protein Quantification T2 - Preprints N2 - qNMR is a valuable technique for metrological studies due to the uniformity of its signal response for all chemical species of an isotope of interest, which enables compound-independent calibration. However, protein quantification remained challenging as large molecules produce wide, low-intensity signals that reduce the already low sensitivity. Combining qNMR with the hydrolysis of protein samples into amino acids circumvents many of these issues and facilitates the use of NMR spectroscopy for absolute protein and peptide quantification.In this work, different conditions have been tested for quantifying aromatic amino acids and proteins. First, we examined the pH-based signal shifts in the aromatic region. The preferable pH depends on the selection of the amino acids for quantification and which internal standard substance should be used to avoid peak overlap. Several aromatic compounds, such as terephthalic acid, sulfoisophthalic acid, and benzene tricarboxylic acid, have been applied as internal standards. The quantification of amino acids from an amino acid standard, as well as from a certified reference material (bovine serum albumin), was performed. Using the first two suggested internal standards, recovery was ~ 97 % for histidine, phenylalanine, and tyrosine at a concentration of approximately 1 mM in solution. Acidic hydrolysis of a certified reference material (CRM) of bovine serum albumin (BSA) and subsequent quantification of Phe and Tyr yielded recoveries of 98 ± 2 and 88 ± 4 %, respectively, at a protein concentration of 16 g/L or 250 µM. KW - Amino acid analysis KW - AAA KW - Protein hydrolysis KW - Metrology KW - Traceability KW - Reference materials KW - Internal standards KW - Calibration PY - 2022 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-564520 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202211.0569.v1 SP - 1 EP - 13 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-56452 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Schroeder, Barbara A1 - Le Xuan, Hoa A1 - Völzke, Jule L. A1 - Weller, Michael G. T1 - Preactivation crosslinking – An efficient method for the oriented immobilization of antibodies T2 - Preprints N2 - Crosslinking of proteins for their irreversible immobilization on surfaces is a proven and popular method. However, many protocols lead to random orientation and the formation of undefined or even inactive by-products. Most concepts to obtain a more targeted conjugation or immobilization requires the recombinant modification of at least one binding partner, which is often impractical or prohibitively expensive. Here a novel method is presented, which is based on the chemical preactivation of Protein A or G with selected conventional crosslinkers. In a second step, the antibody is added, which is subsequently crosslinked in the Fc part. This leads to an oriented and covalent immobilization of the immunoglobulin with a very high yield. Protocols for Protein A and Protein G with murine and human IgG are presented. This method may be useful for the preparation of columns for affinity chromatography, immunoprecipitation, antibodies conjugated to magnetic particles, permanent and oriented immobilization of antibodies in biosensor systems, microarrays, microtitration plates or any other system, where the loss of antibodies needs to be avoided, and maximum binding capacity is desired. This method is directly applicable even to antibodies in crude cell culture supernatants, raw sera or protein-stabilized antibody preparations without any purification nor enrichment of the IgG. This new method delivered much higher signals as a traditional method and, hence, seems to be preferable in many applications. KW - Antibody coating KW - Proximity-enhanced reaction KW - Immunoglobulins KW - IgG KW - Protein G KW - Protein A KW - Immunoprecipitation KW - Immunocapture KW - Stabilization KW - Biosensor KW - Biochip KW - Microarray KW - ELISA KW - Immunoassay KW - Immunosensor KW - Crosslinker KW - Nanoparticles KW - Click chemistry KW - Herceptin KW - Trastuzumab PY - 2019 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-478797 DO - https://doi.org/10.20944/preprints201904.0205.v1 SP - 1 EP - 17 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-47879 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Bahri, Marwa T1 - Ortsspezifische Biokonjugation von humanen Antikörpern mit IgG-bindenden Peptiden T2 - Masterarbeit N2 - Es wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue Methode der Biokonjugation entwickelt, die es ermöglicht humane Antikörper ortspezifisch mit IgG-bindenden Peptiden zu konjugieren. Als Basis fungierte ein Peptid, welches für den Einsatz gezielt modifiziert wurde. So sollte am C-Terminus ein Biotin eingefügt werden, dass für die spätere Detektion der Biokonjugation genutzt werden kann, während am N-Terminus ein Cross-Linker für die kovalente Bindung zum Antikörper eingefügt wurde. Das Biotin wurde mittels Biotin-Lysin eingebaut. Dies hat den Vorteil, dass die modifizierte Aminosäure direkt in der SPPS genutzt werden kann. Auch der Cross-Linker soll schon während der SPPS in das Peptid integriert werden. Als Cross Linker wurden die zwei heterobifunktionellen Succinimidyl(3-bromoacetamid)propionate und Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat untersucht. Die Aktivierung des Peptides mit dem SBAP-Cross-Linker erfolgte am besten im pH-Bereich zwischen 7,0 und 9,0. Die Modifizierung des Peptides mit dem Iodid-Cross-Linker SIAB unter den gleichen Bedingungen zeigte allerdings keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Da das erste Peptid allerdings in den Folgeexperimenten sehr gute Ergebnisse zeigte, musste kein weiterer Linker getestet werden. Zusätzlich zu der Cross-Linker-Wahl sollte der Abstand zwischen dem Cross-Linker und dem Grundgerüst des Peptides auf den Einfluss der Bindung untersucht werden. Dazu wurden drei Kontrollpeptide synthetisiert, die entweder um zwei Aminosäuren zwischen dem ursprünglichen N-Terminus des Peptides und dem SBAP-Linker verlängert wurden, keinen SBAP-Linker beinhalten oder die Verlängerung ohne SBAP-Linker besaßen. Die erfolgreiche Synthese aller vier Peptide wurde mittels MALDI-TOF-MS bestätigt. KW - Peptide KW - Bioconjugation KW - Crosslinker PY - 2020 SP - 1 EP - 82 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54659 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Tchipilov, Teodor A1 - Raysyan, Anna A1 - Weller, Michael G. T1 - Methods for the quantification of particle-bound protein – Application to reagents for lateral-flow immunoassays (LFIA) T2 - Preprints N2 - Protein immobilization for the functionalization of particles is used in various applications, including biosensors, lateral-flow immunoassays (LFIA), bead-based assays, and others. Common methods for the quantification of bound protein are measuring protein in the supernatant before and after coating and calculating the difference. This popular approach has the potential for a significant overestimation of the amount of immobilized protein since layers not directly bound to the surface (soft protein corona) are usually lost during washing and handling. Only the layer directly bound to the surface (hard corona) can be used in subsequent assays. A simplified amino acid analysis method based on acidic hydrolysis and RP-HPLC-FLD of tyrosine and phenylalanine (aromatic amino acid analysis, AAAA) is proposed to directly quantify protein bound to the surface of gold nano- and latex microparticles. The results are compared with indirect methods such as colorimetric protein assays, such as Bradford, bicinchoninic acid (BCA), as well as AAAA of the supernatant. For both particle types, these indirect quantification techniques show a protein overestimation of up to 1700% compared to the direct AAAA measurements. In addition, protein coating on latex particles was performed both passively through adsorption and covalently through EDC/sulfo-NHS chemistry. Our results showed no difference between the immobilization methodologies. This finding suggests that usual protein determination methods are no unambiguous proof of a covalent conjugation on particles or beads. KW - Soft protein corona KW - Hard protein corona KW - Gold particles KW - Nanoparticles KW - Mikroparticles KW - Antibody KW - Bioconjugation KW - Protein quantification KW - Supernatant KW - Sodium chloride method KW - Covalent conjugation KW - Latex particles KW - Lateral flow immunoassays PY - 2022 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-545365 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202203.0332.v1 SP - 1 EP - 8 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-54536 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Tscheuschner, Georg A1 - Kaiser, Melanie N. A1 - Lisec, Jan A1 - Beslic, D. A1 - Muth, Thilo A1 - Krüger, M. A1 - Mages, H.-W. A1 - Dorner, B. G. A1 - Knospe, J. A1 - Schenk, J. A. A1 - Sellrie, F. A1 - Weller, Michael G. T1 - MALDI-TOF-MS-based identification of monoclonal murine anti-SARS-CoV-2 antibodies within one hour T2 - Preprints N2 - During the SARS-CoV-2 pandemic, many virus-binding monoclonal antibodies have been developed for clinical and diagnostic purposes. This underlines the importance of antibodies as universal bioanalytical reagents. However, little attention is given to the reproducibility crisis that scientific studies are still facing to date. In a recent study, not even half of all research antibodies mentioned in publications could be identified at all. This should spark more efforts in the search for practical solutions for the traceability of antibodies. For this purpose, we used thirty-five monoclonal antibodies against SARS-CoV-2 to demonstrate how sequence-independent antibody identification can be achieved by simple means applied onto the protein. First, we examined the intact and light chain masses of the antibodies relative to the reference material NIST-mAb 8671. Already half of the antibodies could be identified based solely on these two parameters. In addition, we developed two complementary peptide mass fingerprinting methods with MALDI-TOF-MS that can be performed in 45 minutes and had a combined sequence coverage of over 80%. One method is based on the partial acidic hydrolysis of the protein by 5 mM of sulfuric acid at 99 °C. Furthermore, we established a fast way for a tryptic digest without an alkylation step. We were able to show that the distinction of clones is possible simply by a brief visual comparison of the mass spectra. In this work, two clones originating from the same immunization gave the same fingerprints. Later, a hybridoma sequencing confirmed the sequence identity of these sister clones. In order to automate the spectral comparison for larger libraries of antibodies, we developed the online software ABID 2.0 (https://gets.shinyapps.io/ABID/). This open-source software determines the number of matching peptides in the fingerprint spectra. We propose that publications and other documents critically relying on monoclonal antibodies with unknown amino acid sequences should include at least one antibody fingerprint. By fingerprinting an antibody in question, its identity can be confirmed by comparison with a library spectrum at any time and context. KW - SARS-CoV-2 antibody KW - Reproducibility crisis KW - Peptide mass fingerprinting KW - Monoclonal antibody KW - Traceability KW - Antibody identification KW - Identity KW - Antibody light chain KW - MALDI-TOF-MS KW - Trypsin KW - Acidic cleavage KW - Antibody subclass KW - Database KW - Peak overlap KW - ABID KW - Sulfuric acid KW - Online software KW - Sequencing KW - Peptide coverage PY - 2022 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-545182 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202203.0229.v1 SN - 2310-287X SP - 1 EP - 24 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-54518 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Völzke, Jule L. A1 - Hodjat Shamami, P. A1 - Gawlitza, Kornelia A1 - Feldmann, Ines A1 - Zimathies, Annett A1 - Weller, Michael G. T1 - High-purity corundum as support for affinity extractions from complex samples T2 - Preprints N2 - Nonporous corundum powder, known as an abrasive material in the industry, was functionalized covalently with protein binders to isolate and enrich specific proteins from complex matrices. The materials based on corundum were characterized by TEM, ESEM, BET, DLS, and zeta potential measurements. The strong Al-O-P bonds between the corundum surface and amino phosphonic acids are used to introduce functional groups for further conjugations. The common cross-linker glutaraldehyde was compared with a hyperbranched polyglycerol (PG) of around 10 kDa. The latter is oxidized with periodate to generate aldehyde groups that can covalently react with the amines of the surface and the amino groups from the protein via a reductive amination process. The amount of bound protein was quantified via aromatic amino acid analysis (AAAA). This work shows that oxidized polyglycerol can be used as an alternative to glutaraldehyde. With polyglycerol, more of the model protein bovine serum albumin (BSA) could be attached to the surface under the same conditions, and lower nonspecific binding (NSB) was observed. As a proof of concept, IgG was extracted with protein A from crude human plasma. The purity of the product was examined by SDS-PAGE. A binding capacity of 1.8 mg IgG per g of corundum powder was achieved. The advantages of corundum are the very low price, extremely high physical and chemical stability, pressure resistance, favorable binding kinetics, and flexible application. KW - Protein KW - Bioseparation KW - Purification KW - Immunoprecipitation KW - Affinity chromatography KW - Polyglycerol KW - Glutaraldehyde KW - Linker KW - Bioconjugation KW - Self-assembled monolayer (SAM) KW - Periodate oxidation KW - Reductive amination KW - Antibodies KW - Igg KW - Immunoglobulins KW - Carrier KW - Solid phase KW - Hyperbranched polymer KW - Aromatic amino acid analysis aaaa PY - 2022 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-555142 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202208.0004.v1 SP - 1 EP - 13 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-55514 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Hiller, Lukas T1 - Herstellung und Charakterisierung eines rekombinanten Anti-Tetanus-Antikörpers aus verschiedenen Säugerzelllinien N2 - Antikörper sind in der medizinischen Welt nicht mehr wegzudenken. Ihr Einsatz-Repertoire als Therapeutika für die Behandlung diverser Krankheiten und Infektionen weitet sich von Jahr zu Jahr mehr aus. Dabei basiert ein Großteil der verwendeten Antikörper zu diesem Zeitpunkt auf monoklonalen Antikörpern auf Basis von Hybridomazellen. Doch hier könnten rekombinante Antikörper aufgrund ihrer Vektor-basierten Expression eine vielversprechende und womöglich sogar revolutionierende Alternative bieten. So ergeben sich neue Optimierungsoptionen für Merkmale wie Affinität, Stabilität und Kompatibilität über Anpassungen auf genetischer oder posttranslationaler Ebene. Allerdings ergibt sich kein Anwendungszweck ohne die vorhergehende detaillierte Charakterisierung der Antikörper. Denn nur mit spezifischem Wissen über die diversen Eigenschaften und Wechselwirkungen kann eine effektive und präzise Verwendung in der Diagnostik und Therapeutik gewährleistet werden und auf diese Weise Leben retten. Aus diesem Grund beschäftigt sich diese Masterarbeit mit der Vertiefung der rekombinanten Antikörper-Thematik. Dazu soll ein Anti-Tetanus-Antikörper erstmals rekombinant in verschiedenen Zelllinien hergestellt und anschließend über umfangreiche analytische Verfahren mit einem Fokus auf die Einflussanalyse der unterschiedlichen posttranslationalen Glykosylierungen charakterisiert werden. Zu diesem Zweck wurden als Grundlage einerseits zwei P1316-Dual-Expressions-Vektoren mit variierenden Insert-Positionen der schweren und leichten Kette durch Gibson-Assembly sowie individuellen pRK5-Plasmide für eine separiert Expression der Antikkörperketten mithilfe Restriktionsfragment-Ligation generiert. In einer Gegenüberstellung der der Expressionsausbeuten stellte sich die Überlegenheit der P1316-Plasmid-Konfiguration heraus, in der das Leichtketten-Insert an der ersten Expressionsstelle positioniert ist. Deshalb wurde dieser Vektor als Ausgangspunkt für die anschließende hochskalierten Herstellung des Anti-Tetanus-Antikörpers in Expi293F-GnTI- und ExpiCHO-S-Zellen verwendet. Ein ELISA bestätigte die Bindungsaktivität der rekombinanten Antikörper am Tetanus-Toxoid unabhängig vom Expressionssystem. Nach einer folgenden Optimierung der für die Aufreinigung verwendeten Protein-A-Affinitätschromatographie, wurde über weitere Charakterisierungsmethoden wie Größenausschlusschromatographie und dynamische Lichtstreuung eine vergleichbare Aggregation aufgrund der sauren Elution aufgezeigt. In diesem Kontext wurde die Notwendigkeit einer Zweistufen-Präparation mit Affinitäts- und Größenausschlusschromatografie für den Erhalt monodisperser Proben verdeutlicht. Zudem wurden die verschiedenen intakten Massen mitsamt ihrer spezifischen Glykan-abhängigen Streumaßen in Relation zum monoklonalen NISTmAB-Referenzantikörper bestimmt. Dabei konnte den Erwartungen nach sowohl die geringere Masse als auch die uniformere Glykosylierung der in Expi293 GnTI- exprimierten Immunoglobuline in Relation zum ExpiCHO-S-Antikörper nachgewiesen werden. Anschließend wurde das Stabilitätsverhalten mittels thermischer Entfaltung und dynamischer Lichtstreuung über einen ausgeweiteten Zeitraum sowie verschiedenen Temperaturen dokumentiert. Grundlegend wurde eine höhere thermische Stabilität der zweiten konstanten Schwerketten-Domäne des aus ExpiCHO-S-Zellen stammenden Antikörpers nachgewiesen. Außerdem konnte eine problemlose Lagerungsfähigkeit beider unterschiedlich glykosylierter Antikörper bei Raumtemperatur für mindestens 4 Wochen festgestellt werden. Des Weiteren wurde die Langzeitlagerung im Rahmen der Auswirkung von Gefrier-Auftau-Zyklen mit gleichbleibenden Methoden sowie zusätzlicher Größenausschlusschromatographie erprobt. Hierbei stellte sich der Erhalt der strukturellen Integrität nach bis zu 15 Zyklen heraus. Allerdings geht die Monodispersität bereits nach wenigen Zyklen verloren, wobei die geringfügiger glykosylierten Expi293F-GnTI-Anti-Tetanus-Antikörper eine stärkere Beeinträchtigung durch multiple Gefrier-Auftau-Zyklen aufwiesen. KW - Rekombinante Antikörper KW - Affinitätschromatographie KW - Größenausschlusschromatographie KW - MALDI-TOF-MS KW - Dynamische Lichtstreuung PY - 2024 SP - 1 EP - 120 CY - Berlin AN - OPUS4-59865 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Völzke, Jule Lexa T1 - Herstellung und Charakterisierung Antigen-beschichteter Nanopartikel als Analoga von Virus-like Particles (VLP) T2 - Masterarbeit N2 - In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Nanomaterialien auf ihre Bindungsfähigkeit zu Proteinen untersucht. Zu Beginn standen dabei die Herstellung stabiler Dispersionen der einzelnen Nanopartikel und die Stabilität der gebildeten Konjugate im Vordergrund. Der Nachweis einer erfolgreichen Konjugatbildung, sprich der Beschichtung von Nanopartikel mit Proteinen, wurde sowohl qualitativ mittels DLS-Messungen als auch über quantitative Protein-Bestimmungen erbracht. Für die Quantifizierung konnten verschiedene Methoden eingesetzt werden. Neben der klassischen Vorgehensweise, welche indirekt über die Quantifizierung von ungebundenem Protein im Überstand erfolgt, konnten ihm Rahmen dieser Arbeit verschiedene direkte Bestimmungsmethoden entwickelt werden. So wurden mittels kolorimetrischer Tests, wie dem BCA-Assay und dem Bradford-Assay, Nanodiamantdispersionen mit Hilfe einer Korrekturwellenlänge vermessen und quantifiziert. Ebenso zum Einsatz kam die Methode der Aminosäureanalytik, welche aufgrund ihrer guten Rückführbarkeit auf Aminosäurestandards Ergebnisse mit hoher Richtigkeit generieren kann und ebenso die Detektion kleiner Proteinmengen möglich macht. Nach den erfolgten quantitativen Betrachtungen wurden die Protein-beschichteten Nanopartikel auf ihre Anwendbarkeit als Analoga von Virus-like Particles (VLP) bei einer Immunisierung zur Gewinnung von polyklonalen Antikörpern gegen humanes Ceruloplasmin in Kaninchen überprüft. Es konnte mittels ELISA gezeigt werden, dass die Konjugate erfolgreich für die Herstellung von Antikörpern eingesetzt werden können und im zeitlichen Verlauf einer Immunisierung eine Steigerung des Antikörper-Titers zu erreichen ist. KW - DLS KW - Dynamische Lichtstreuung KW - Aluminiumoxid KW - Nanodiamant KW - Gold-Nanopartikel KW - BSA KW - Albumin KW - Protein G KW - Ceruloplasmin KW - Immunpräzipitation KW - Ultraschall KW - BCA KW - Bradford-Assay KW - AAAA KW - Aromatische Aminosäureanalytik KW - ICP-MS KW - NaCl-Methode PY - 2018 SP - 1 EP - 107 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54625 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Le Xuan, Hoa T1 - Gezieltes Crosslinking von Immunglobulinen mit ortspezifischen Bindern T2 - Masterarbeit N2 - Die neue Crosslinking-Methode ist hilfreich, um Immunglobuline des Isotyps G ortspezifisch an ihrer Bindungsstelle mit Protein A oder G zu konjugieren. Die Kopplungen von Protein A und G konnten erfolgreich an Maus- und Human-IgG durchgeführt, sowie die Bedingungen untersucht und optimiert werden. Die Aktivierung von Protein G mit Glutaraldehyd erfolgt am besten bei pH 8 und die anschließende Kopplung mit Maus-IgG1 bei einem pH-Wert von 6. Jedoch wurden mit SIAB und Sulfo-SIAB als Crosslinker im Vergleich zu Glutaraldehyd noch höhere Signale erhalten. Für die Kopplung von SIAB sind 40% DMSO im Reaktionspuffer günstig, währenddessen Sulfo-SIAB gut wasserlöslich ist daher keine Lösungsvermittler benötigt. Es ergab sich ein optimaler pH-Wert von 7,4 um Protein A mit SIAB zu aktivieren und den gleichen pH-Wert um die Kopplung mit Maus-IgG1 durchzuführen. Für die Kopplung von Protein G mit Maus-IgG1 hingegen zeigten die Experimente, dass ein leicht saurer pH-Wert bei pH 6 für den IgG-Kopplungsschritt am günstigsten ist. Während die Inkubationszeit von Maus-IgG1 mit Protein G bei 16 h liegt, muss mit Protein A bis zu 40 h inkubiert werden, um das Kopplungsmaximum zu erreichen. Des Weiteren wurde das Crosslinking von Human-IgG (Herceptin) mit SIAB untersucht. Dabei zeigte sich, wie in der Abbildung 47 zu sehen ist, dass Protein A und G vergleichbar gut an Human-IgG zu koppeln sind. Für das Crosslinking von Protein G mit Maus-IgG1 ist dagegen ein deutlich besserer Umsatz im Vergleich zu Protein A zu erkennen (Abbildung 48). Heterobifunktionale Linker können mit der reaktiveren Gruppe die erste Bindung eingehen, um erst nach Zugabe eines weiteren Reagenzes die zweite Bindung auszubilden und zudem intramolekulare Reaktionen möglichst zu vermeiden. KW - Antikörper KW - Antibodies KW - Vernetzung KW - Immobilisierung KW - Immobilization KW - Herceptin KW - Human antibodies KW - Therapeutic antibodies KW - Diagnostic antibodies KW - Oriented immobilization PY - 2019 SP - 1 EP - 100 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54658 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Tscheuschner, Georg A1 - Schwaar, Timm A1 - Weller, Michael G. T1 - Fast Confirmation of Antibody Identity by MALDI-TOF-MS Fingerprints T2 - Preprints N2 - Thousands of antibodies for diagnostic and other analytical purposes are on the market. However, it is often difficult to identify duplicates, reagent changes, and to assign the correct original publications to an antibody. This slows down scientific progress and might even be a cause of irreproducible research and a waste of resources. Recently, activities were started to suggest the sole use of recombinant antibodies in combination with the open communication of their sequence. In this case, such uncertainties should be eliminated. Unfortunately, this approach seems to be rather a long-term vision since the development and manufacturing of recombinant antibodies remain quite expensive in the foreseeable future. Also, nearly all commercial antibody suppliers may be reluctant to publish the sequence of their antibodies, since they fear counterfeiting. De-novo sequencing of antibodies is also not feasible today for a reagent user without access to the hybridoma clone. Nevertheless, it seems to be crucial for any scientist to have the opportunity to identify an antibody undoubtedly to guarantee the traceability of any research activity using antibodies from a third party as a tool. For this purpose, we developed a method for the identification of antibodies based on a MALDI-TOF-MS fingerprint. To circumvent lengthy denaturation, reduction, alkylation, and enzymatic digestion steps, the fragmentation was performed with a simple formic acid hydrolysis step. Eighty-nine unknown monoclonal antibodies were used for this study to examine the feasibility of this approach. Although the molecular assignment of peaks was rarely possible, antibodies could be easily recognized in a blinded test, simply from their mass-spectral fingerprint. A general protocol is given, which could be used without any optimization to generate fingerprints for a database. We want to propose that in most scientific projects relying critically on antibody reagents, such a fingerprint should be established to prove and document the identity of the used antibodies and to assign a specific reagent to a datasheet of a commercial supplier, a public database record or an antibody ID. KW - Reproducibility KW - Quality Control KW - Traceability KW - Diagnostics KW - ELISA KW - Immunoassay PY - 2020 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:b43-506590 DO - https://doi.org/10.20944/preprints202002.0207.v1 SN - 2310-287X SP - 1 EP - 17 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-50659 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Tscheuschner, Georg T1 - Entwicklung einer Methode zur schnellen Identifikation von Antikörpern mittels MALDI-TOF-MS T2 - Masterarbeit N2 - Im Vergleich zu anderen Proteinen ist die Identifizierung von Antikörpern anhand ihrer Sequenz zum Beispiel mittels "peptide mass fingerprinting" schwierig. Da die Sequenzinformation eines Antikörpers aufgrund der hypersomatischen Mutation während der Affinitätsreifung nicht im Genom eines Organismus gespeichert ist, kann die Aminosäuresequenz nicht auf einfachem Weg der DNA-Sequenzierung gewonnen werden. Das ist nur in seltenen Fällen möglich, wenn dem Endanwender der Zellklon der Antikörper-produzierenden Zelle zugänglich ist. Eine Sequenzierung auf Protein-Ebene ist sehr aufwändig und teuer und wird daher fast nie für die Charakterisierung von analytischen Antikörpern verwendet. Der Mangel an Validierung dieser analytischen Antikörper, die bei Experimenten verwendeten werden, löst aber eine Reihe Probleme aus, die die Wiederholbarkeit dieser Experimente schwierig und in einigen Fällen unmöglich macht. Das sorgt jährlich für verschwendete Forschungsgelder in Milliardenhöhe und hindert den wissenschaftlichen Fortschritt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer einfachen und schnellen Methode, die es trotzdem ermöglicht, die Identifikation von Antikörpern sicherzustellen. Dazu wurde eine Methode basierend auf dem "peptide mass fingerprinting" gewählt. Das Problem der unbekannten Aminosäuresequenz der Antikörper wurde gelöst, indem lediglich die Peptidmuster der entstehenden Fingerprint-Spektren zur Identifikation herangezogen wurden. MALDI wurde dabei als Ionisationsmethode für die Massenspektrometrie gewählt, da die resultierenden Spektren im Gegensatz zu ESI-MS einfach auszuwerten sind. Auch kann auf eine vorige Trennung der Peptide mittels LC verzichtet werden, was zusätzlich Analysenzeit spart. Für die Proteinspaltung wurde eine simple saure Hydrolyse mittels Ameisensäure gewählt. Im Vergleich zum herkömmlichen Trypsin-Verdau konnten auf zeitraubende Arbeitsschritte wie Denaturierung, Reduktion und Alkylierung der Antikörper verzichtet werden. Die Hydrolyse mittels Ameisensäure wurde bisher nur auf kleine und mittelgroße Proteine angewendet, sodass im ersten Teil dieser Arbeit mehrere Schritte optimiert wurden bevor zufriedenstellende Fingerprint-Spektren von Antikörpern erhalten wurden. KW - Peptide KW - Fingerprint KW - Peptide mass fingerprinting KW - Massenspektrometrie KW - Saure Hydrolyse KW - Festphasenextraktion KW - Protein G KW - Ameisensäure KW - ABID KW - Korrelationsmatrix PY - 2019 SP - 1 EP - 116 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54626 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Linke, Michael T1 - Entwicklung einer magnetischen Anreicherungsmethode für Peptidbibliotheken zur Identifizierung von Proteinbindern T2 - Masterarbeit N2 - Das Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer magnetischen Anreicherungsmethode für eine Bead-basierte Substanzbibliothek zur Identifizierung von Proteinbindern. Im Ramen des Forschungsbelegs wurde bereits eine Anreicherungsmethode für ein Modellsystem einer Peptidbibliothek entwickelt. Das Modellsystem bestand dabei aus zwei verschiedenen Peptiden. Als Positivkontrolle wurde das FLAG-Peptid gewählt, welches selektiv gegen den Anti-FLAG-Antikörper bindet, und ein weiteres Peptid wurde als Negativkontrolle gewählt. Anhand dieses Modellsystems konnte die zuvor entwickelte Anreicherungsmethode von 20.000 auf 1.000.000 Beads vergrößert werden. Hierbei wurde ein Anreicherungsfaktor von 818 und eine gute Wiederfindungsrate von 82% erreicht. KW - Peptide library KW - OBOC library KW - Enrichment KW - Magnetic beads KW - Protein interaction PY - 2018 SP - 1 EP - 86 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54651 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Gabler, Mariella T1 - Development of an affinity-based method for the site-selective synthesis of antibody-drug-conjugates T2 - Masterarbeit N2 - For the site-selective synthesis of ADCs, a variety of obstacles must be overcome. Those include designing bifunctional affinity peptides with reasonably low 𝐾𝑑-values that couple to the mAb in a site-selective manner. These peptides should also include a functional group that links the payload to the mAb under mild conditions without adversely affecting it. The bioconjugation between peptide and antibody and the linker between peptide and payload must be stable and durable to provide safety when used for medical purposes. The usage of metals and organic solvents should be minimized. Within the project, new types of functionalized affinity peptides were designed, and their affinity towards the Fc-fragment was determined. KW - Antibody drug conjugate KW - ADC KW - Human antibody KW - Peptide KW - Linker KW - Toxin KW - Payload KW - Monomethyl Auristatin E KW - MMAE KW - DM1 KW - Click chemistry KW - Copper-catalyzed KW - SDS-PAGE KW - HPLC KW - Trastuzumab KW - Herceptin KW - SPR KW - MALDI-TOF-MS KW - Mertansine KW - Site-selective bioconjugation KW - Affinity PY - 2021 SP - 1 EP - 100 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54519 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER -