TY - GEN A1 - Tscheuschner, Georg T1 - Entwicklung einer Methode zur schnellen Identifikation von Antikörpern mittels MALDI-TOF-MS N2 - Im Vergleich zu anderen Proteinen ist die Identifizierung von Antikörpern anhand ihrer Sequenz zum Beispiel mittels "peptide mass fingerprinting" schwierig. Da die Sequenzinformation eines Antikörpers aufgrund der hypersomatischen Mutation während der Affinitätsreifung nicht im Genom eines Organismus gespeichert ist, kann die Aminosäuresequenz nicht auf einfachem Weg der DNA-Sequenzierung gewonnen werden. Das ist nur in seltenen Fällen möglich, wenn dem Endanwender der Zellklon der Antikörper-produzierenden Zelle zugänglich ist. Eine Sequenzierung auf Protein-Ebene ist sehr aufwändig und teuer und wird daher fast nie für die Charakterisierung von analytischen Antikörpern verwendet. Der Mangel an Validierung dieser analytischen Antikörper, die bei Experimenten verwendeten werden, löst aber eine Reihe Probleme aus, die die Wiederholbarkeit dieser Experimente schwierig und in einigen Fällen unmöglich macht. Das sorgt jährlich für verschwendete Forschungsgelder in Milliardenhöhe und hindert den wissenschaftlichen Fortschritt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer einfachen und schnellen Methode, die es trotzdem ermöglicht, die Identifikation von Antikörpern sicherzustellen. Dazu wurde eine Methode basierend auf dem "peptide mass fingerprinting" gewählt. Das Problem der unbekannten Aminosäuresequenz der Antikörper wurde gelöst, indem lediglich die Peptidmuster der entstehenden Fingerprint-Spektren zur Identifikation herangezogen wurden. MALDI wurde dabei als Ionisationsmethode für die Massenspektrometrie gewählt, da die resultierenden Spektren im Gegensatz zu ESI-MS einfach auszuwerten sind. Auch kann auf eine vorige Trennung der Peptide mittels LC verzichtet werden, was zusätzlich Analysenzeit spart. Für die Proteinspaltung wurde eine simple saure Hydrolyse mittels Ameisensäure gewählt. Im Vergleich zum herkömmlichen Trypsin-Verdau konnten auf zeitraubende Arbeitsschritte wie Denaturierung, Reduktion und Alkylierung der Antikörper verzichtet werden. Die Hydrolyse mittels Ameisensäure wurde bisher nur auf kleine und mittelgroße Proteine angewendet, sodass im ersten Teil dieser Arbeit mehrere Schritte optimiert wurden bevor zufriedenstellende Fingerprint-Spektren von Antikörpern erhalten wurden. KW - Peptide KW - Fingerprint KW - Peptide mass fingerprinting KW - Massenspektrometrie KW - Saure Hydrolyse KW - Festphasenextraktion KW - Protein G KW - Ameisensäure KW - ABID KW - Korrelationsmatrix PY - 2019 SP - 1 EP - 116 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54626 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Schroeder, Barbara A1 - Le Xuan, Hoa A1 - Völzke, Jule L. A1 - Weller, Michael G. T1 - Preactivation crosslinking – An efficient method for the oriented immobilization of antibodies N2 - Crosslinking of proteins for their irreversible immobilization on surfaces is a proven and popular method. However, many protocols lead to random orientation and the formation of undefined or even inactive by-products. Most concepts to obtain a more targeted conjugation or immobilization requires the recombinant modification of at least one binding partner, which is often impractical or prohibitively expensive. Here a novel method is presented, which is based on the chemical preactivation of Protein A or G with selected conventional crosslinkers. In a second step, the antibody is added, which is subsequently crosslinked in the Fc part. This leads to an oriented and covalent immobilization of the immunoglobulin with a very high yield. Protocols for Protein A and Protein G with murine and human IgG are presented. This method may be useful for the preparation of columns for affinity chromatography, immunoprecipitation, antibodies conjugated to magnetic particles, permanent and oriented immobilization of antibodies in biosensor systems, microarrays, microtitration plates or any other system, where the loss of antibodies needs to be avoided, and maximum binding capacity is desired. This method is directly applicable even to antibodies in crude cell culture supernatants, raw sera or protein-stabilized antibody preparations without any purification nor enrichment of the IgG. This new method delivered much higher signals as a traditional method and, hence, seems to be preferable in many applications. KW - Antibody coating KW - Proximity-enhanced reaction KW - Immunoglobulins KW - IgG KW - Protein G KW - Protein A KW - Immunoprecipitation KW - Immunocapture KW - Stabilization KW - Biosensor KW - Biochip KW - Microarray KW - ELISA KW - Immunoassay KW - Immunosensor KW - Crosslinker KW - Nanoparticles KW - Click chemistry KW - Herceptin KW - Trastuzumab PY - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:b43-478797 SP - 1 EP - 17 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-47879 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Paul, Martin A1 - Weller, Michael G. T1 - Antibody Screening by Microarray Technology – Direct Identification of Selective High-Affinity Clones N2 - The primary screening of hybridoma cells is a time-critical and laborious step during the development of monoclonal antibodies. Often critical errors occur in this phase, which supports the notion that the generation of monoclonal antibodies with hybridoma technology is difficult to control and hence a risky venture. We think that it is crucial to improve the screening process to eliminate most of the immanent deficits of the conventional approach. With this new microarray-based procedure, several advances could be achieved: Selectivity for excellent binders, high throughput, reproducible signals, avoidance of misleading avidity (multivalency) effects, and simultaneous performance of competition experiments. The latter can directly be used to select clones of desired cross-reactivity properties. In this paper, a model system with two excellent clones against carbamazepine, two weak clones and blank supernatant has been designed to examine the effectiveness of the new system. The excellent clones could be detected largely independent of the IgG concentration, which is unknown during the clone screening since the determination and subsequent adjustment of the antibody concentration is not possible in most cases. Furthermore, in this approach, the enrichment, isolation, and purification of IgG for characterization is not necessary. Raw cell culture supernatant can be used directly, even when fetal calf serum (FCS) or other complex media had been used. In addition, an improved method for the oriented antibody-immobilization on epoxy-silanized slides is presented. Based on the results of this model system, we conclude that this approach should be preferable to most other protocols leading to many of false positives, causing expensive and lengthy confirmation steps to weed out the poor clones. KW - Hybridoma KW - Monoclonal Antibodies KW - Clones KW - Competitive Immunoassay KW - Hapten Immunoassay KW - False Positives PY - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:b43-506621 SN - 2310-287X SP - 1 EP - 17 PB - MDPI CY - Basel AN - OPUS4-50662 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Luco Colilles, Arnau T1 - Evaluation of two compact near-infrared spectrometers for the detection of microplastics in soil samples N2 - In the last years, the Process Analytical Technology (PAT) research field has become of great importance due to its connection with the industrial world. This industry related research, along with the evolutionary progress that technology has seen lately, has allowed that key analytical techniques in an industrial environment have undergone a radical development. One of these techniques has been the near-infrared spectroscopy (NIRS). This technique, currently common in "online" industrial analysis, has seen a remarkable revolution, especially since the introduction of the microelectromechanical systems technology (MEMS) in the spectroscopy field. Nowadays it is possible to find compact spectrometers no bigger than a wristwatch in the market. Although there is an unavoidable question: can these compact spectrometers actually compete against the traditional spectrometers? In this project different calibration parameters of two compact NIR spectrometers ("Spectral Engines Oy NIR-One Sensor NM2.0", with 1550 to 1950 nm range; and "NeoSpectra Si-ware", with 1300 to 2550 nm range) were evaluated, and the obtained results were compared with a reference spectrometer ("Bruker Optik GmbH Matrix-F", with 15000 to 4000 cm–1 range). In order to obtain the different calibration parameters, a sequence of quality performance tests were conducted. The results obtained after the different experiments carried out with both compact spectrometers prove that their performance is more than acceptable for routine analysis. Afterward, model samples of different microplastics in soil at different known concentration were analyzed with all three spectrometers. Chemometric models capable to identify and classify microplastics in soil were established. For this analysis five of the most used plastics worldwide were used: polyethylene (PE), polyethylene terephthalate (PET), polypropylene (PP), polystyrene (PS), and polyvinyl chloride (PVC). After the Principal component analysis (PCA), it can be seen that only the NIR-One NM2.0 is capable to differentiate all types of microplastics in soil at concentrations of 1–2 %, while the NeoSpectra Si-ware is unable to identify the PET sample. KW - Near-infrared KW - Microplastics KW - Compact spectrometers PY - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:b43-511626 UR - http://hdl.handle.net/2445/138198 SP - 1 EP - 29 PB - Universitat de Barcelona CY - Barcelona AN - OPUS4-51162 LA - eng AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Le Xuan, Hoa T1 - Gezieltes Crosslinking von Immunglobulinen mit ortspezifischen Bindern N2 - Die neue Crosslinking-Methode ist hilfreich, um Immunglobuline des Isotyps G ortspezifisch an ihrer Bindungsstelle mit Protein A oder G zu konjugieren. Die Kopplungen von Protein A und G konnten erfolgreich an Maus- und Human-IgG durchgeführt, sowie die Bedingungen untersucht und optimiert werden. Die Aktivierung von Protein G mit Glutaraldehyd erfolgt am besten bei pH 8 und die anschließende Kopplung mit Maus-IgG1 bei einem pH-Wert von 6. Jedoch wurden mit SIAB und Sulfo-SIAB als Crosslinker im Vergleich zu Glutaraldehyd noch höhere Signale erhalten. Für die Kopplung von SIAB sind 40% DMSO im Reaktionspuffer günstig, währenddessen Sulfo-SIAB gut wasserlöslich ist daher keine Lösungsvermittler benötigt. Es ergab sich ein optimaler pH-Wert von 7,4 um Protein A mit SIAB zu aktivieren und den gleichen pH-Wert um die Kopplung mit Maus-IgG1 durchzuführen. Für die Kopplung von Protein G mit Maus-IgG1 hingegen zeigten die Experimente, dass ein leicht saurer pH-Wert bei pH 6 für den IgG-Kopplungsschritt am günstigsten ist. Während die Inkubationszeit von Maus-IgG1 mit Protein G bei 16 h liegt, muss mit Protein A bis zu 40 h inkubiert werden, um das Kopplungsmaximum zu erreichen. Des Weiteren wurde das Crosslinking von Human-IgG (Herceptin) mit SIAB untersucht. Dabei zeigte sich, wie in der Abbildung 47 zu sehen ist, dass Protein A und G vergleichbar gut an Human-IgG zu koppeln sind. Für das Crosslinking von Protein G mit Maus-IgG1 ist dagegen ein deutlich besserer Umsatz im Vergleich zu Protein A zu erkennen (Abbildung 48). Heterobifunktionale Linker können mit der reaktiveren Gruppe die erste Bindung eingehen, um erst nach Zugabe eines weiteren Reagenzes die zweite Bindung auszubilden und zudem intramolekulare Reaktionen möglichst zu vermeiden. KW - Antikörper KW - Antibodies KW - Vernetzung KW - Immobilisierung KW - Immobilization KW - Herceptin KW - Human antibodies KW - Therapeutic antibodies KW - Diagnostic antibodies KW - Oriented immobilization PY - 2019 SP - 1 EP - 100 PB - Humboldt-Universität zu Berlin CY - Berlin AN - OPUS4-54658 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER - TY - GEN A1 - Jacobasch, Stefan A1 - Duffner, Eric A1 - Goedecke, Thomas A1 - Portella, Pedro Dolabella A1 - Mair, Georg A1 - Schendler, Thomas A1 - Gradt, Thomas A1 - Askar, Enis A1 - Bartholmai, Matthias A1 - Schröder, Volkmar A1 - Maiwald, Michael A1 - Holtappels, Kai A1 - Tschirschwitz, Rico A1 - Neumann, Patrick P. T1 - Unser Beitrag zum Thema Wasserstoff N2 - Die BAM ist nahezu über die gesamte Wertschöpfungskette hinweg wissenschaftlich tätig. Von der sicheren und effizienten Wasserstofferzeugung (POWER-to-GAS), über die (Zwischen-)Speicherung von Wasserstoff in Druckgasspeichern bis hin zum Transport bspw. mittels Trailerfahrzeug zum Endverbraucher. Komplettiert werden die Aktivitäten der BAM durch die sicherheitstechnische Beurteilung von wasserstoffhaltigen Gasgemischen, die Verträglichkeitsbewertung von Werkstoffen bis hin zur Detektion von Wasserstoffkonzentrationen über geeignete Sensorik, auch mittels ferngesteuerter Messdrohnen (sog. UAV-Drohnen). Zudem untersucht die BAM proaktiv Schadensrisiken und Unfallszenarien für die Sicherheitsbetrachtung, um mögliche Schwachstellen aufzeigen und potenzielle Gefährdungen erkennen zu können. KW - Wasserstoff KW - Wasserstofferzeugung KW - Energiespeicherung KW - Gasdetektion KW - Risikoanalyse KW - Power-to-Gas KW - Explosionsschutz KW - Tribologie KW - Druckgasspeicher KW - Glasspeicher KW - Gassensorik KW - Mini-UAV PY - 2019 SP - 1 CY - Berlin AN - OPUS4-47960 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER -