TY - GEN A1 - Bayram, Rabia T1 - Rekombinante Herstellung einer Amin-Oxidase aus Aspergillus niger und deren Einsatz in der Biosensorik T2 - Masterarbeit N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die rekombinante Herstellung der AnFAO in E. coli, welche ursprünglich von A. niger produziert wird, und deren anschließende Anwendung in der Entwick-lung eines Fumonisin- Biosensors für die Lebensmittelanalytik. In Bezug auf die aktuell steigen-den Lebensmittel- und Rohstoffpreise ist die Entwicklung eines Schnelltestsystems zur Detektion von Kontaminationen mit Mykotoxinen besonders gefragt, da zusätzliche Verluste und Kosten verhindert werden können. Für die Herstellung der AnFAO als MBP-Fusionsprotein und Biotin-Fusionsprotein mit zusätzlichem 6x His-Tag wurden die pET-MBP-AnFAO und pRSET-BH6-An-FAO Expressionsvektoren erfolgreich konstruiert. Die lösliche Expression im Cytoplasma wurde von MBP-AnFAO erreicht, wobei die Expression von BH6-AnFAO in inclusion bodies erfolgte und keine Aktivität des Enzyms nachgewiesen wurde. Die Enzymaktivität von MBP-AnFAO wurde im optischen Assay und amperometrisch durch die Detektion von H2O2 ermittelt. Im optischen Assay wurde die maximale spezifische Aktivität von 2,45 U/mg bei 45 °C, einer Enzymkonzentration von 3 μM und 50 μM FB1 erreicht. Generell wurden mit FB1 als Enzymsubstrat höhere Fluoreszenzsig-nale und dementsprechend höhere Enzymaktivitäten als für FB2 beobachtet. Es wurde ein linearer Zusammenhang der Enzymaktivitäten mit der Substratkonzentration beobachtet. Außerdem wurde ein Anstieg der H2O2-Konzentration mit zunehmender Inkubationszeit (bis zu 60 Minuten) erkannt. Des Weiteren wurde der Einfluss des MBP-Fusionsproteins auf die Enzymaktivität des AnFAO untersucht. Dabei wurde anhand von wesentlich geringeren Aktivitäten für AnFAO allein ein eventueller Einfluss des MBP auf dessen Aktivität festgestellt. Ein elektrochemischer Aufbau wurde zur Entwicklung eines Fumonisin- Sensors genutzt. Dazu wurde nachgewiesen, dass FB1 von rekombinant hergestelltem MBP-AnFAO unter Bildung von NH3 und H2O2 zu weniger toxi-schem FB1, dem FPy1, oxidiert werden kann. An der PB/Kohlenstoff-Elektrode, welche sensitiver gegenüber H2O2 und stabiler als die CoPC/Kohlenstoff Elektrode war, wurde die Reduktion des enzymatisch gebildeten H2O2 gemessen. Die Erstellung einer FB1- Kalibriergerade mit FB1- Lösun-gen verschiedener Konzentrationen zeigte, dass das Enzym auch in immobilisierter Form in der Lage ist unterschiedliche Konzentrationen an FB1 zu desaminieren. Dazu gehört auch der Kon-zentrationsbereich unterhalb des festgelegten Grenzwertes von 2,7 μmol/kg für Fumonisin. Die amperometrischen Kurven hierfür wurden an der PB/Kohlenstoff-Elektrode erfolgreich aufge-nommen. Störungen des H2O2- Redoxstroms durch das Enzym, der Enzymsubstrate und der Ne-benprodukte während der amperometrischen Messung wurden ausgeschlossen. Sowohl im opti-schen als auch im amperometrischen Assay wurde ausschließlich das enzymatisch gebildete H2O2 bestimmt. KW - Fumonisin KW - Mykotoxin KW - rekombinante Protein Expression KW - Amperometrie PY - 2022 SP - 1 EP - 104 PB - Berliner Hochschule für Technik CY - Berlin AN - OPUS4-57724 LA - deu AD - Bundesanstalt fuer Materialforschung und -pruefung (BAM), Berlin, Germany ER -