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    <title>OPUS 4 Latest Documents RSS Feed</title>
    <description>Latest documents</description>
    <link>http://opus4.kobv.de/opus4-ubbayreuth/index/index/</link>
    <pubDate>Wed, 28 Apr 2004 10:04:39 +0200</pubDate>
    <lastBuildDate>Wed, 28 Apr 2004 10:04:39 +0200</lastBuildDate>
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      <title>Strukturelle Untersuchung des Antiterminationskomplexes von EIAV</title>
      <link>http://opus4.kobv.de/opus4-ubbayreuth/frontdoor/index/index/docId/73</link>
      <description>In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Untersuchungen am Antiterminationskomplex von EIAV durchgeführt. Die Auswertung von Tripleresonanz-NMR-Experimenten ermöglichte die sequentielle Zuordnung der Resonanzen von 13C/15N-markiertem EIAV-Tat. Zum ersten Mal konnten mit Hilfe dieser Zuordnung strukturelle Veränderungen des Proteins bei der Wechselwirkung mit TAR-RNA, Cyclin T1 und dem Inhibitor TF53 auf der Basis einzelner Aminosäuren direkt in einem 15N-1H-HSQC-Spektrum beobachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass das EIAV-Tat-Protein ohne die Beteiligung weiterer Bindungspartner an die TAR-RNA bindet. Bei dieser Bindung erfahren die Core-Domäne (Tyrosin-35 bis Tyrosin-49) und das argininreiche Motiv (ARM; Arginin-55 bis Lysin-63) von EIAV-Tat strukturelle Veränderungen, wobei auch der zwischen diesen beiden Domänen liegende Linker (Leucin-50 bis Leucin-54) betroffen ist. Auf RNA-Ebene deutet die Analyse der Imino-Protonen-Verschiebungen auf strukturelle Veränderungen bei der Tat-Wechselwirkung hin, die sich aber auf den Stamm der RNA nur wenig auswirken, so dass von einer Bindung an die ungepaarten Basen der Loopregion ausgegangen werden kann. Die Untersuchung der Interaktionen von EIAV-Tat mit TF53 – einem Inhibitor der HIV-Tat/TAR-Bindung – ergab, dass dieser auch an das virale Protein aus EIAV bindet und dabei – ähnlich wie die TAR-RNA – strukturelle Veränderungen der Core- und ARM-Region induziert. Die Veränderungen des Tat-Proteins, die bei der TF53-Bindung beobachtet wurden, stimmen mit denen der TAR-Bindung zu einem großen Teil überein; Unterschiede sind nur bei wenigen Resonanzen zu erkennen. Offensichtlich bindet der Inhibitor zwar nicht an alle Aminosäuren, die bei der Wechselwirkung mit TAR-RNA beteiligt sind. Beispielsweise sind die für die TAR-Bindung wichtigen Reste Arginin-55 und Asparagin-58 hier nicht betroffen. TF53 bedingt aber ähnliche strukturelle Veränderungen des Tat-Proteins, so dass die TAR-Bindung gehemmt werden könnte. Die Wechselwirkungen von EIAV-Tat mit dem Wirtsfaktor Cyclin T1 wurden anhand verschiedener Systeme untersucht. Da die Reinigungen von Pferde-Cyclin T1 (eCycT1) und einer His-tagged Form von eCycT1 trotz erfolgreicher Expression beider Proteine in E. coli nicht zu einer ausreichend konzentrierten Lösung führten, wurde die Reinigung einer V29L-Mutante von humanem Cyclin T1 (hCycT1_V29L) mittels Ammoniumsulfat-Fällung und einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) etabliert. Das an EIAV-Tat bindende hCycT1_V29L konnte bis zu 80 µM konzentriert werden. Erste CD- und NMR-spektroskopische Untersuchungen belegen, dass sowohl eCycT1 als auch hCycT1_V29L hauptsächlich a-helikale Strukturelemente besitzen. Es konnte zudem gezeigt werden, dass hCycT1_V29L Wechselwirkungen mit EIAV-Tat über Leucine eingeht. Dabei sind neben einigen bereits in der TAR-Bindung involvierten Resten der Core- und Linker-Region auch die Leucine-74 und 75 beteiligt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit der 272 Aminosäuren großen CyclinT1-Proteine wurden zudem Untersuchungen mit verkürzten Cyclin-Varianten durchgeführt, die nur die wichtigen amino- und carboxyterminalen Bereiche von Cyclin T1 – verbunden durch einen FKSG-Linker – enthielten. Das daraus abgeleitete synthetische Peptid Mini_eCyc_45 und das etwas längere in E. coli überexprimierte und über Heparin-Sepharose gereinigte Mini_eCyc_75 zeigen in CD- und 1D-NMR-Spektren keine reguläre Sekundärstruktur. Beide Mini-Cycline gehen mit EIAV-Tat nur geringe Wechselwirkungen ein, die sich lediglich bei der Interaktion mit Mini_eCyc_75 in wenigen Verschiebungen der Seitenketten-Resonanzen im 15N-1H-HSQC beobachten lassen. Eine Verstärkung der zwischen zwei Bindungspartnern auftretenden Wechselwirkungen wurde bei der Untersuchung von ternären Interaktionen zwischen EIAV-Tat, TAR-RNA und Mini_eCyc_45 beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Mini_ eCyc_45 zusätzliche strukturelle Veränderungen der TAR-RNA bewirkt. Anhand der Veränderungen im 15N-1H-HSQC von EIAV-Tat konnte ebenso gezeigt werden, dass sich – ähnlich wie bei der Bindung von hCycT1_V29L an Tat – wahrscheinlich mehrere Leucine an dieser ternären Interaktion beteiligen.</description>
      <author>Marc Ehnert</author>
      <category>doctoralthesis</category>
      <guid>http://opus4.kobv.de/opus4-ubbayreuth/frontdoor/index/index/docId/73</guid>
      <pubDate>Wed, 28 Apr 2004 10:04:39 +0200</pubDate>
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