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    <title>OPUS 4 Latest Documents RSS Feed</title>
    <description>Latest documents</description>
    <link>http://opus4.kobv.de/opus4-ubbayreuth/index/index/</link>
    <pubDate>Sat, 04 Sep 2010 09:02:39 +0200</pubDate>
    <lastBuildDate>Sat, 04 Sep 2010 09:02:39 +0200</lastBuildDate>
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      <title>Elektrochemische Detektion von RNA mittels Nukleinsäurehybridisierung</title>
      <link>http://opus4.kobv.de/opus4-ubbayreuth/frontdoor/index/index/docId/545</link>
      <description>Die Nukleinsäureanalytik, insbesondere die RNA-Analytik, ist ein wichtiges Werkzeug für die Diagnostik von pathogenen Mikroorganismen in der Medizin und Lebensmittelüberwachung. Weiterhin besitzt der Nachweis von RNA-Molekülen bei der Transkriptomanalytik in der Grundlagenforschung eine zentrale Bedeutung. Ziel der Arbeit war die Entwicklung neuartiger Detektionsverfahren für unterschiedliche RNA-Spezies. Die schnelle und einfache Durchführbarkeit, aber auch die Parameter Selektivität und Sensitivität der entwickelten Techniken waren dabei von besonderer Bedeutung. Zunächst wurde die Detektionsmethode anhand der Identifizierung von Mikroorganismen mittels 16S rRNA-Sandwich-Hybridisierung etabliert und optimiert. Mit Hilfe von 16S rRNA-Sequenzdatenbanken wurden geeignete Sondensequenzen zur spezifischen Erkennung von verschiedenen Bakterien ermittelt. Die prokaryontische 16S rRNA wurde unter Verwendung des thermostabilen Reporterenzyms Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius durch eine Ein-Schritt Sandwich-Hybridisierung nachgewiesen. Ein Spezies-spezifisches Oligodesoxynukleotid wird auf der Goldelektrode eines elektrochemisch-auslesbaren Biochips immobilisiert und bindet die bakterielle 16S rRNA. Zeitgleich bindet ein kovalentes Konjugat aus Esterase 2 und Detektions-Oligodesoxynukleotid an einem konservierten Bereich der 16S rRNA. Nach Optimierung dieses Nachweissystems wurde eine Nachweisgrenze von 500 Kolonie bildenden Einheiten Escherichia coli ermittelt. Neben der guten Sensitivität konnte eine gute Spezifität bis hin zur Stammdiskriminierung gezeigt werden. Gleichzeitig konnten mehrere Bakterien in einem Ansatz identifiziert werden. Die Validierung dieses neuartigen bakteriellen Nachweissystems erfolgte mit realen Fleischproben. Das Hygienerecht der EU verlangt die Kontrolle mikrobiologischer Kriterien während der gesamten Prozesskette der Lebensmittelherstellung. Klassische mikrobiologische Verfahren sind hierfür jedoch nur bedingt geeignet. Biosensoren in integrierten Analysesystemen könnten in Zukunft hierfür Verwendung finden und die Analytik beschleunigen und vereinfachen. Die Optimierung der Probenvorbereitung und der Biochipmessung führte zu einem Gesamtanalyseprozess, bestehend aus Kurzanreicherung, RNA-Isolierung und Biochipmessung, welcher den spezifischen E. coli Nachweis von einer Kolonie bildenden Einheit pro mL Probe innerhalb von sieben Stunden ermöglicht. Daher ist diese Methode prinzipiell sehr gut für die Anwendung in der Lebensmittelproduktion geeignet. Eine Signalamplifikation der elektrochemischen Nukleinsäuredetektion wurde durch Herstellung eines neuartigen Reporterenzymkonjugats erreicht. Dazu wurden mehrere Esterase 2-Moleküle auf der Oberfläche eines Polyamidoamin-Dendrimers der Generation 3 verankert, während ein Detektions-Oligodesoxynukleotid mit dem Kern des Dendrimers kovalent verknüpft wurde. Die Selektivität der Bakterienidentifizierung blieb bei Verwendung dieses Reporterenzymkonjugats unverändert gut. Jedoch wurde bei Verwendung des mehrfach markierten Dendrimers eine Nachweisgrenze von 50 Kolonie bildenden Einheiten Escherichia coli erreicht, was eine zehnfache Verbesserung der Nachweisgrenze im Vergleich zum vorher beschriebenen Esterase 2-Oligodesoxynukleotid-Konjugat darstellt. Derzeit stellt die schnelle und sensitive Expressionsanalyse von microRNAs eine große Herausforderung dar. Kürzlich wurde zudem gezeigt, dass diese als Biomarker für die Tumordiagnostik dienen können. Deshalb wurde auf Basis des etablierten Sandwich-Hybridisierungssystems ein so genannter Lückenhybridisierungsnachweis entwickelt. Eine Hybridisierung von immobilisiertem Fänger-Oligodesoxynukleotid, Esterase 2-Detektionsoligodesoxynukleotid und komplementärer RNA-Probe lässt eine Lücke zwischen Fänger- und Detektionssonde. Diese Lücke destabilisiert den Komplex, was bei höheren Temperaturen zu einem Zerfall führt. Ist dagegen die gewünschte microRNA anwesend, füllt diese die Lücke zwischen Fänger- und Detektionssonde aus, stabilisiert den Hybridisierungskomplex und immobilisiert das Reporterenzym in der Nähe der Elektrode. Dieses kann folglich elektrochemisch detektiert werden. Mittels Lückenhybridisierung konnten verschiedene microRNAs diskriminiert werden. Selbst einzelne Fehlbasenpaarungen führten zu einem signifikanten Signalabfall. Die Nachweisgrenze für microRNA beträgt 2 pM bzw. 2 attomol ohne jegliche vorherige Amplifikation der Nukleinsäuren. Nach Isolation der Gesamt-RNA aus einer humanen Mammakarzinomzelllinie konnte mit dieser Methode ein Expressionsprofil von vier verschiedenen microRNAs innerhalb von 60 Minuten erstellt werden. Die Methode der Lückenhybridisierung wurde auch erfolgreich auf die schnelle Expressionsanalyse von Boten-RNAs aus prokaryontischen und eukaryontischen Zellen angewandt.</description>
      <author>Christopher Pöhlmann</author>
      <category>doctoralthesis</category>
      <guid>http://opus4.kobv.de/opus4-ubbayreuth/frontdoor/index/index/docId/545</guid>
      <pubDate>Fri, 09 Apr 2010 09:02:39 +0200</pubDate>
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