Warten auf die Transkription: Die humanen Elongationsfaktoren NELF und DSIF

Awaiting transcription: the human elongation factors NELF and DSIF

Die humanen Elongationsfaktoren negative elongation factor (NELF) und 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity inducing factor (DSIF) sind Schlüsselfaktoren beim promotorproximalen Arretieren in der frühen Elongationsphase der Transkription. Dabei interagieren beide Faktoren direkt mit RNA-Polymerase II. NELF bindet über die RNA recognition motif (RRM)-Domäne der Untereinheit E zusätzlich an die naszierende RNA. Eine derartige Transkriptionsblockade tritt auch während dDie humanen Elongationsfaktoren negative elongation factor (NELF) und 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity inducing factor (DSIF) sind Schlüsselfaktoren beim promotorproximalen Arretieren in der frühen Elongationsphase der Transkription. Dabei interagieren beide Faktoren direkt mit RNA-Polymerase II. NELF bindet über die RNA recognition motif (RRM)-Domäne der Untereinheit E zusätzlich an die naszierende RNA. Eine derartige Transkriptionsblockade tritt auch während der Transkription des Genoms des humanen Immunschwächevirus 1 (HIV-1) Provirus auf. NELF bindet hierbei an die Haarnadel-Struktur der naszierenden RNA (HIV-1 TAR RNA). Ein Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Analyse der RRM-Domäne von NELF E sowie die Untersuchung einer möglichen sequenzspezifischen Bindung von NELF E RRM an HIV-1 TAR RNA. Außerdem galt es, die Struktur der kleinen Untereinheit von DSIF, hSpt4, zu bestimmen und ihre Interaktion mit der NGN-Domäne der großen DSIF-Untereinheit hSpt5 näher zu charakterisieren. Die Struktur der RRM-Domäne von NELF E wurde mittels magnetischer Kernresonanz (NMR) bestimmt (PDB: 2BZ2) und besteht aus einem viersträngigen Faltblatt mit zwei alpha-Helices, die gegen eine Seite des Faltblattes packen. An der RNA-Bindung sind die zentralen beta-Stränge mit den beiden aromatischen Resten Tyr43 und Phe77 aus dem Konsensussequenzmotiv ribonucleoprotein domain 2 (RNP2) bzw. RNP1 involviert. Der in der freien Form unstrukturierte C-Terminus der RRM bildet in der gebundenen Form (PDB: 2JX2) eine 3-10-Helix aus, die höchstwahrscheinlich direkt an der RNA-Bindung beteiligt ist. RRM-Domänen gelten als klassische einzelstrangbindende Domänen. Die prognostizierte Bindestelle von NELF E ist jedoch die doppelsträngige HIV-1 TAR RNA Stammregion. Die durchgeführten 15N-NMR-Titrationsexperimente und Fluoreszenzgleichgewichtstitrationen mit die HIV-1 TAR RNA umfassenden RNA Oligonukleotiden zeigten, dass NELF E RRM präferentiell einzelsträngige RNA bindet. Die ermittelten KD-Werte lagen dabei alle im niederen mikromolekularen Bereich. NELF E RRM zeigt somit im Vergleich zu anderen RRM-Domänen eine schwächere Affinität für RNA. Eine sequenzspezifische Bindung an die HIV-1 TAR RNA konnte, auch in Versuchen mit der gesamten NELF E Untereinheit, nicht beobachtet werden. Vieles deutet somit darauf hin, dass RNA-Bindung durch NELF E sequenzunabhängig stattfindet. Der Zeitpunkt der RNA-Bindung während der Elongation der Transkription wird womöglich durch andere Faktoren bzw. Ereignisse gesteuert. NELF übt seine inhibitorische Wirkung nur im Zusammenspiel mit dem Elongationsfaktor DSIF aus, über den es nur wenig strukturelle Informationen gibt. Die Koexpression von hSpt4 mit der NusG N-terminalen Homologie Domäne von hSpt5 (hSpt5-NGN) als dessen Interaktionspartner ermöglichte die Bestimmung der Kristallstruktur von hSpt4/hSpt5-NGN bis zu einer Auflösung von 1.55 Å (PDB: 3H7H). hSpt5-NGN besteht aus einem zentralen, viersträngigen Faltblatt und aus einzelnen Helices, die von beiden Seiten gegen das Faltblatt packen. hSpt4 verfügt über ein zwei- und ein dreisträngiges Faltblatt, die senkrecht zueinander angeordnet sind und sich auf der Interaktionsfläche zugewandten Seite befinden. Zusätzliche helikale Elemente werden durch den ausgebildeten Zinkfinger fixiert. Die Komplexstruktur ist von einem zentralen sechssträngigen intermolekularen beta-Faltblatt geprägt. hSpt4/hSpt5-NGN zeigt sehr große Strukturähnlichkeit zur kürzlich publizierten homologen Komplexstruktur von Spt4/Spt5-NGN aus S. cerevisiae. Ein für die Bindung essentieller Glutamatrest (E338) von Spt5-NGN ist auch in hSpt5-NGN konserviert (E228). Der Komplex hSpt4/hSpt5-NGN(E228Q) konnte wegen der Unlöslichkeit von hSpt5-NGN(E228Q) nicht gereinigt werden. Dies deutet an, dass die Interaktion zwischen hSpt4 und hSpt5-NGN(E228Q) gestört ist. Somit ist E228 von hSpt5-NGN höchstwahrscheinlich ebenso essentiell für die Wechselwirkung mit hSpt4 wie im homologen Hefekomplex. hSpt5-NGN hat auch strukturelle Ähnlichkeiten zur N-terminalen Domäne (NTD) des bakteriellen Transkriptionsfaktors NusG. E. coli (Ec)NusG-NTD verfügt an der Position des Glutamatrestes über einen Glutaminrest (Q72). hSpt4-Bindung an EcNusG-NTD bzw. EcNusG-NTD(Q72E) wurde jedoch nicht beobachtet. Ein möglicher Grund dafür ist die unterschiedliche Ladungsverteilung an der hSpt4-Bindungsfläche. hSpt4 besitzt hingegen Ähnlichkeiten zum archaealen Transkriptionsfaktor RpoE‘‘. Überlagerung der Strukturen von hSpt4 und RpoE‘‘ aus P. furiosus (PDB: 1RYQ) zeigten, dass beide den Zinkfinger und die senkrecht zueinander angeordneten Faltblätter gemein haben. Strukturbestimmung sowie funktionelle Analyse von NELF E RRM und hSpt4/hSpt5-NGN repräsentieren somit einen weiteren Schritt auf dem Weg zur Entschlüsselung der komplexen zellulären Vorgänge während der eukaryontischen Transkription.show moreshow less
The human transcription factors negative elongation factor (NELF) and 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity inducing factor (DSIF) are key factors in transcriptional pausing during early elongation. Pausing of the transcription machinery is induced by binding of both factors to the RNA polymerase II. Additionally, NELF interacts with the nascent RNA transcript via its E subunit. A similar pausing event has been detected for the transcription of the proviral human immThe human transcription factors negative elongation factor (NELF) and 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity inducing factor (DSIF) are key factors in transcriptional pausing during early elongation. Pausing of the transcription machinery is induced by binding of both factors to the RNA polymerase II. Additionally, NELF interacts with the nascent RNA transcript via its E subunit. A similar pausing event has been detected for the transcription of the proviral human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) genome, in which NELF E binds to the hairpin structure of the nascent RNA transcript termed TAR RNA. The aim of this work was the structural analysis of the E subunit of NELF. An emphasis was put on the investigation of a sequence specific binding of the RNA recognition motif (RRM) domain to RNA. Additionally, the structure of the small hSpt4 subunit of DSIF was to be determined and the interaction of hSpt4 with the large DSIF subunit hSpt5 should be characterized. The solution structure of NELF E RRM (PDB: 2BZ2) was determined by nuclear magnetic resonance (NMR) and consists of a four stranded antiparallel sheet and two helices, that pack against the sheet. Residues located in the central beta-sheet are involved in RNA binding, including the two aromatic residues Tyr43 and Phe77 of the consensus motifs ribonucleoprotein domain 2 (RNP2) and RNP1, respectively. The solution structure of the RNA-bound form of NELF E RRM (PDB: 2JX2) clearly showed, that it comprises a 3-10-helix at the C-terminus, which is directly involved in RNA binding. In contrast, the C-terminus of the unbound form is unstructured and highly flexible. While RRM domains are considered as truly single strand binding domains, the HIV-1 TAR RNA stem region is the proposed binding site of NELF E. 15N-NMR titration experiments and fluorescence equilibrium titrations performed with short RNA oligonucleotides covering the HIV-1 TAR RNA stem region showed that NELF E RRM preferentially binds single stranded RNA. All KD-values calculated were in the lower micromolar range, indicating a rather weak binding affinity to RNA as compared to other known RRM domains. Furthermore, no sequence specific binding of NELF E RRM as well as of the full length NELF E was observed. The obtained results indicated that NELF E binds RNA in a sequence independent manner. Furthermore, fluorescence equilibrium titration experiments with the full length NELF E subunit also failed to show a sequence specific binding to HIV-1 TAR RNA confirming that RNA binding of NELF is independent of the RNA sequence. RNA binding of NELF during transcription might therefore be regulated by other cellular factors or events. NELF action is dependent on the presence of DSIF, of which only little structural information is available. Coexpression of hSpt4 and the NusG N-terminal homology domain of hSpt5 (hSpt5-NGN), enabled the determination of the crystal structure of hSpt4/hSpt5-NGN up to a resolution of 1.55 Å (PDB: 3H7H). hSpt5-NGN contains a central four-stranded antiparallel sheet and several α-helices which pack against the sheet. hSpt4 harbors one two- and one three-stranded antiparallel sheet which are arranged perpendicularly to each other. Additional alpha-helices are stabilized by the zinc finger. A central intermolecular six-stranded antiparallel sheet is formed in the hetero-dimer. hSpt4/hSpt5-NGN shows high structural similarity to the recently published homologous Spt4/Spt5-NGN complex of S. cerevisiae. A glutamate residue (E338) of Spt4/Spt5-NGN was shown to be essential for Spt4 binding. It is also conserved in hSpt4/hSpt5-NGN(E228). hSpt4/hSpt5-NGN(E228Q) could not be purified due to the insolubility of hSpt5-NGN(E228Q). This indicates that the interaction between hSpt5-NGN(E228Q) and hSpt4 is disrupted. Therefore, E228 of hSpt5-NGN seems to be essential for hSpt4 binding in the human complex as well. Additionally, hSpt5 shows structural similarities to the N-terminal domain (NTD) of the bacterial transcription factor NusG. E. coli (Ec)NusG harbors a glutamine residue (Q72) at the position corresponding to E228 of hSpt5-NGN, but does not bind to hSpt4. Also, EcNusG-NTD (Q72E) shows no binding affinity for hSpt4. This may be due to differences in charge distribution at the hSpt4 binding interface of hSpt5-NGN in comparison to EcNusG-NTD. hSpt4 exhibits structural similarities to the archaeal transcription factor RpoE’’. Comparison of hSpt4 with RpoE’’ from P. furiosus (PDB: 1RYQ) showed, that both factors inherit the zinc finger region and the beta-sheets. Structure determination and functional analysis of NELF E RRM and hSpt4/hSpt5-NGN is another step forward to encrypt the complex cellular events during eukaryotic transcription.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Sabine Wenzel
Advisor:Prof. Dr. Paul Rösch
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:06.05.2010
Year of Completion:2009
SWD-Keyword:Fluoreszenz; Genregulation; Kristallstruktur; NMR-Spektroskopie; Transkriptionsfaktor
Tag:Elongationsfaktor; NMR-Struktur; eukaryontische Transkription
NMR structure; crystal structure; eukaryotic transcription; promoter proximal pausing
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
RVK - Regensburg Classification:WD 2200
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-7218
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):06.08.2010