Struktur, Funktion und Allergenität Bet v 1-homologer Proteine: Das Allergen Gly m 4 und das Enzym Norcoclaurin-Synthase

Structure, Function and Allergenicity of Bet v 1-homologous Proteins: The Allergen Gly m 4 and the Enzyme Norcoclaurine Synthase

In Nord- und Mitteleuropa wird ein beträchtlicher Teil der Pollen- und Nahrungsmittelallergien bei Erwachsenen durch allergene Proteine aus der Bet v 1-Familie ausgelöst, die nach dem Hauptbirkenpollenallergen benannt ist. Die Bet v 1-Familie wird in die Klasse 10 der pathogenesis-related proteins (PR10-Proteine) eingeordnet. Die PR10-Proteine spielen eine Rolle im „Immunsystem“ der Pflanze, wobei die genaue physiologische Funktion dieser Proteine bis heute nicht bestimmt werden konnte. Die struIn Nord- und Mitteleuropa wird ein beträchtlicher Teil der Pollen- und Nahrungsmittelallergien bei Erwachsenen durch allergene Proteine aus der Bet v 1-Familie ausgelöst, die nach dem Hauptbirkenpollenallergen benannt ist. Die Bet v 1-Familie wird in die Klasse 10 der pathogenesis-related proteins (PR10-Proteine) eingeordnet. Die PR10-Proteine spielen eine Rolle im „Immunsystem“ der Pflanze, wobei die genaue physiologische Funktion dieser Proteine bis heute nicht bestimmt werden konnte. Die strukturelle Untersuchung der Mitglieder der Bet v 1-Familie kann nicht nur neue Erkenntnisse bezüglich ihrer physiologischen Funktion erbringen, sondern stellt auch eine wichtige Voraussetzung für die Herstellung hypoallergener Proteinvarianten zur Verwendung in der Immuntherapie dar. Bisher konnten die Strukturen dreier verschiedener Bet v 1-Allergene gelöst werden, die alle die typische Bet v 1-Faltungstopologie aufweisen: ein siebensträngiges, antiparalleles beta-Faltblatt und zwei kurze V-förmig angeordnete alpha-Helices, die zusammen mit einer langen C-terminalen alpha-Helix einen hydrophoben Hohlraum umschließen. Die in dieser Arbeit mittels magnetischer Kernspinresonanz-(NMR-)Spektroskopie im Detail bestimmte Struktur des Bet v 1-Homologs Gly m 4 aus der als Nahrungsmittelzusatz verwendeten Sojabohne gehört ebenfalls diesem Faltungstyp an. In einigen strukturellen Einzelheiten aber zeigt Gly m 4 größere Ähnlichkeit zu drei PR10-Proteinen aus der gelben Lupine als zu Bet v 1. Die Ergänzung der gewonnenen strukturellen Informationen durch immunologische Daten ermöglichte die Lokalisierung von vier potentiellen kreuzreaktiven IgE-Epitopen auf der Oberfläche von Gly m 4, welche die molekulare Grundlage für Kreuzallergien auf Birkenpollen und Sojaprodukte darstellen. Auch die enzymatisch aktiven (S)-Norcoclaurin-Synthasen (NCS) zeigen Sequenzähnlich-keiten mit Bet v 1, jedoch in wesentlich geringerem Maße als die „klassischen“ Bet v 1-Allergene. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Kombination von Circulardichroismus- und NMR-Spektroskopie mit der Methode der Homologiemodellierung ein semi-experimentelles Strukturmodell der NCS aus der Alkaloid-produzierenden Pflanze Thalictrum flavum konstruiert werden. Anhand dieses Modells konnte gezeigt werden, dass auch die NCS die typische Bet v 1-Faltungstopologie aufweist, wobei jedoch die C-terminale alpha-Helix in drei Abschnitte unterteilt ist. Erst kürzlich wurde das Modell weitgehend durch die Kristallstruktur des Proteins bestätigt. Die NCS ist somit ein echtes Mitglied der Bet v 1-Superfamilie, in der sie im Hinblick auf ihre bekannte physiologische Funktion eine Ausnahme darstellt. Sie katalysiert einen wichtigen Schritt in der Synthese pharmakologisch aktiver Sekundärmetabolite, die Kondensation von 4-Hydroxyphenylacetaldehyd und Dopamin zu (S)-Norcoclaurin. Anhand von NMR-Titrationsexperimenten mit Substrat bzw. Substratanalogon und Untersuchung des Oligomerisierungszustands in An- und Abwesenheit der Substrate konnten erste Einblicke in das aktive Zentrum des Enzyms und dessen Reaktionsmechanismus gewonnen werden. Aktivitätstests mit Bet v 1 zeigten, dass das Hauptbirkenpollenallergen hingegen nicht in der Lage ist, die NCS-Reaktion zu katalysieren. Bezüglich des Nutzens der NCS für die Erforschung kreuzreaktiver Epitope stellt das Enzym aufgrund seiner im Zuge dieser Arbeit ermittelten strukturellen und immunologischen Eigenschaften einen interessanten Kandidaten für das sogenannte Epitope grafting dar. Ziel dieser Methode ist es, eine bestimmte Bindungsstelle eines Proteins auf ein anderes Protein zu übertragen. In diesem Fall soll mit dem Ziel der detaillierten Charakterisierung der Antikörper-Bindungsstelle ein potentielles IgE-Epitop von Bet v 1 auf die strukturell sehr ähnliche, aber kaum kreuzreaktive NCS übertragen werden.show moreshow less
In Northern and Central Europe, a considerable percentage of pollen and food allergies in adults is caused by allergenic proteins of the Bet v 1-family. This protein family whose name is derived from the major birch pollen allergen belongs to class 10 of the pathogenesis-related proteins (PR10 proteins). These proteins play a role in the ‘immune system’ of the plant, but their precise physiological function has not been determined yet. Structural studies of members of the Bet v 1-family will notIn Northern and Central Europe, a considerable percentage of pollen and food allergies in adults is caused by allergenic proteins of the Bet v 1-family. This protein family whose name is derived from the major birch pollen allergen belongs to class 10 of the pathogenesis-related proteins (PR10 proteins). These proteins play a role in the ‘immune system’ of the plant, but their precise physiological function has not been determined yet. Structural studies of members of the Bet v 1-family will not only provide new information regarding their physiological function, but are also an important prerequisite for the production of hypo-allergenic protein variants for immunotherapy. So far, the structures of three different Bet v 1-allergens have been solved. All of them show the typical Bet v 1-fold: a seven-stranded, antiparallel beta-sheet and two short V-shaped alpha-helices which in combination with a long C-terminal alpha-helix form a hydrophobic cavity in the protein. During this work, the three-dimensional structure of the Bet v 1-homologue Gly m 4 from soybean was determined in detail by means of nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. This allergen is frequently found in different kinds of processed foods as soy is used as a food additive. The protein shows the same overall fold as Bet v 1, but certain structural details are more similar to three PR10 proteins from yellow lupine. The correlation of the structural information with immunological data paved the way for the localization of four putative cross-reactive IgE epitopes on the allergen’s surface. These epitopes represent the molecular basis for cross-reactivities on birch pollen and soy products. The enzymatically active (S)-norcoclaurine synthases (NCS) show sequence similarities to Bet v 1 as well, however in a considerably lower extent compared to the ‘classical’ Bet v 1-allergens. In this work, we combined circular dichroism and NMR spectroscopy with homology modeling to build a semi-experimental model of NCS from the alkaloid-producing plant Thalictrum flavum. This model shows that NCS adopts the typical Bet v 1-fold, although the C-terminal alpha-helix is divided into three parts. Very recently, the crystal structure of the protein has been solved, confirming the model in major parts. NCS is thus a true member of the Bet v 1-superfamily. With respect to its well-characterized physiological function, the enzyme represents an exception among the Bet v 1-homologous PR10 proteins. It catalyzes an important step during the synthesis of pharmacologically active secondary metabolites, namely the condensation of 4-hydroxyphenylacetaldehyde and dopamine to (S)-norco-claurine. By means of NMR titration experiments with the substrates or analogues, respectively, and determination of the oligomerization state in absence or presence of the substrates, first insights into the active site of the enzyme and its catalytic mechanism could be provided. Enzyme activity assays with Bet v 1 showed that the major birch pollen allergen is not able to catalyze the NCS reaction. The structural and immunological properties of NCS determined during this work make the enzyme an interesting candidate for epitope grafting. The general purpose of this method is to transfer binding sites between different proteins. Here we tried to transfer a putative IgE epitope of Bet v 1 to the structurally similar but nearly non-cross-reactive NCS aiming to characterize the respective epitope in detail.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Hanna Berkner
Advisor:Prof. Dr. Paul Rösch
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:25.06.2009
Year of Completion:2009
SWD-Keyword:Allergen; Benzylisochinolinalkaloide; NMR-Spektroskopie; Norcoclaurin; Sojabohne
Tag:NMR spectroscopy; allergen; benzylisoquinoline alkaloids; norcoclaurine; soybean
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-5959
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):07.08.2009