Mechanism of carbon monoxide oxidation at the active site [Ni-4Fe-5S] cluster of carbon monoxide dehydrogenase from Carboxydothermus hydrogenoformans

Mechanismus von der Kohlenmonoxid-Oxidation am [Ni-4Fe-5S] aktiven Zentrum der Kohlenmonoxid-Dehydrogenase aus Carboxydothermus hydrogenoformans

Der Kohlenstoffmetabolismus ist angewiesen auf Kohlenmonoxid-Dehydrogenasen (CODH), welche die Oxidation von CO mit H2O zu CO2 katalysieren. Die Kristallstruktur der Ni-Fe CODHIICh, isoliert aus CO gewachsenen Zellen des thermophilen hydrogenogenen anaeroben Bakteriums Carboxydothermus hydrogenoformans, besitzt ein [Ni-4Fe-5S]-Cluster C im aktiven Zentrum, welches waehrend der Oxidation von CO eine bimetallische Ni-(mu2S)-Fe1 Form annimmt. Dem Cluster C anderer aktiver Ni-Fe CODH/s, z.B aus RhodDer Kohlenstoffmetabolismus ist angewiesen auf Kohlenmonoxid-Dehydrogenasen (CODH), welche die Oxidation von CO mit H2O zu CO2 katalysieren. Die Kristallstruktur der Ni-Fe CODHIICh, isoliert aus CO gewachsenen Zellen des thermophilen hydrogenogenen anaeroben Bakteriums Carboxydothermus hydrogenoformans, besitzt ein [Ni-4Fe-5S]-Cluster C im aktiven Zentrum, welches waehrend der Oxidation von CO eine bimetallische Ni-(mu2S)-Fe1 Form annimmt. Dem Cluster C anderer aktiver Ni-Fe CODH/s, z.B aus Rhodospirillum rubrum, Moorella thermoacetica, und rekombinanter, in Escherichia coli exprimierter CODHIICh, fehlt der Ni und Fe überbrückende mu2S, so dass das aktive Zentrum als [Ni-4Fe-4S]-Cluster C vorliegt. Die auf der Basis von Analysen der Kristallstruktur und biochemischen Studien vorgeschlagenen Mechanismen der CO Oxidation beinhalten die apikale Bindung von CO am Ni Ion und die Aktivierung von Wasser am Fe1 Ion des Clusters. Um zu verstehen, wie CO mit dem aktiven Zentrum der nativen CODHIICh interagiert und welche Funktion der verbrückende micro-2S Ligand im Enzym erfüllt, konzentriert sich die vorliegende Studie (i) auf die Interaktion von Cluster C mit dem CO Analogon Cyanid und der Analyse der daraus resultierenden Koordination des Nickels und (ii) auf die Auswirkung von Natriumsulfid auf die enzymatyische Aktivitaet der nativen CODHIICh. Unter katalytischen Bedingungen reagiert Cyanid als ein kompetitiver Inhibitor von CO in CODHIICh. Bei stark niedrigem Redoxpotential (-500 mV, N2, ohne Elektronenakzeptor) inhibiert Cyanid die CODHIICh. Cyanid wirkt unter oxidierenden oder leicht reduzierenden Bedingungen (-320 mV) nicht als Inhibitor. Bei stark niedrigem Redoxpotential (-500 mV) kann Cyanid die CODHIICh nicht inhibieren, wenn gleichzeitig CO vorhanden ist. Hieraus laesst sich ableiten, dass Cyanid das Substrat nachahmt, wenn es mit dem reduzierten aktiven Zentrum interagiert. Die Bindung von Cyanid am Ni Ion wurde durch den Einsatz Roentgenabsorptionsspektroskopie aufgeklaert und durch Roentgenkristallographie bei atomarer Aufloesung bestaetigt. Die Struktur zeigt einen intermediaeren Zustand von Cluster C mit CO in NiFe-CODHIICh. In dieser Reaktion ersetzt Cyanid den mu2S Ligand, was zu einem quadratisch-planaren Nickel mit drei S und einem CN Liganden fuehrt. Cluster C und seine Proteinumgebung werden durch die Bindung von Cyanid signifikant veraendert. Bemerkenswert ist, dass sich Fe1 um 1,1 A verlagert, was den Abstand von Nickel zu Fe1 um 0,1 A verkuerzt. Die Elektronendichte am CN Liganden laesst eine 80 %ige Besetzung vermuten und das N Atom von CN befindet sich Wasserstoffbrueckenbindungsdistanz zu His93 und Lys563, welche im Protonentransfernetzwerk involviert sind. Die Bindung von Cyanid entfernt den verbrückenden mu2S vom Cluster C und es entsteht H2S, wobei die Ni-(mu2S)-Fe1 Bruecke nach dem katalytischem Zyklus wieder hergestellt wird. Es ist wahrscheinlich, dass die hohe CO Oxidationsrate und die Bindung des mu2S den Verlust von Sulfid durch Kontrolle des Diffusionsprozesses verhindern. Die Inhibition von reduzierter CODHIICh wird durch die Freisetzung von Cyanid bei 70 ¡ÆC in der Gegenwart von schwachen Reduktionsmitteln vollstaendig aufgehoben. Das quadratisch-planare NiS4-koordinierte Cluster C wird durch die Reaktivierung mit Sulfid wieder vollstaendig hergestellt. Die Wiederherstellung der Ni-(mu2S)-Fe1 Brücke fuehrt zu einem vollstaendig aktiven Enzym. Im Falle des Verlusts von einem Schwefelatom wird eine NiS3-Koordination und damit ein teilweise aktives Enzym generiert. Ein NiS3-koordiniertes Cluster C wird durch Inkorperation von Sulfid leicht in eine NiS4-Koordination ueberfuehrt. Dies fuehrt zu einer Aktivierung der CO Oxidationsaktivitaet und zur Stabilisierung des Clusters. Zusaetzlich zeigt das NiS4-Cluster C bei niedrigen CO Konzentrationen eine hoehere katalytische Effizienz als das NiS3-Cluster C. Die Inhibition der CO2 Reduktionsaktivitaet durch Sulfid und die hoehere CO2 Reduktionsaktivitaet der NiS3-Konformation lassen vermuten, dass die Bindung von CO2 am Ni durch den mu2S Ligand gestoert wird. Diese Vermutung wird die Kristallstruktur des CO2 gebundenen NiS3-Cluster C bestaetigt. Der micro-2S Ligand beschleunigt die physiologisch relevante CO Oxidation, verhindert die Inhibition durch das Produkt CO2 und inhibiert damit die nicht physiologische CO2 Reduktion. Diese Funktionen des verbrueckenden micro-2S ist fuer den Stoffwechsel von C. hydrogenoformans in einer stark reduzierten, CO limitierten und CO2 reichen vulkanischen Umgebung physiologisch wichtig. Daraus kann abgeleitet werden, dass die [Ni-4Fe-5S]-Form von Cluster C die biologisch relevante Form von CODHIICh darstellt. Ein im Rahmen dieser Arbeit entwickelter Mechanismus der CO Oxidation basiert auf der Struktur des Cyanid und des CO2 gebundenen Zustands von Cluster C sowie auf kinetischen Daten.show moreshow less
The carbon monoxide (CO) metabolism relies on CO-dehydrogenase (CODH) that oxidizes CO with H2O to CO2. The crystal structures of the native Ni-Fe CODHIICh from the CO-grown thermophilic hydrogenogenic anaerobic bacterium Carboxydothermus hydrogenoformans reveal the active site as a [Ni-4Fe-5S] cluster C, carrying a bimetallic Ni-(mu2S)-Fe1 subsite with a bridging mu2S. This is the assumed site, where the oxidation of CO occurs. However, cluster C in other catalytically active Ni-Fe CODHs, from The carbon monoxide (CO) metabolism relies on CO-dehydrogenase (CODH) that oxidizes CO with H2O to CO2. The crystal structures of the native Ni-Fe CODHIICh from the CO-grown thermophilic hydrogenogenic anaerobic bacterium Carboxydothermus hydrogenoformans reveal the active site as a [Ni-4Fe-5S] cluster C, carrying a bimetallic Ni-(mu2S)-Fe1 subsite with a bridging mu2S. This is the assumed site, where the oxidation of CO occurs. However, cluster C in other catalytically active Ni-Fe CODHs, from Rhodospirillum rubrum, Moorella thermoacetica, and recombinant CODHIICh expressed in Escherichia coli, for example, lack the ¥ì2S bridging Ni and Fe and contain a [Ni-4Fe-4S] form of a cluster C. The CO oxidation mechanism proposed based on crystallographical and biochemical studies involved the apical binding of CO at the nickel ion and the activation of water at the Fe1 ion of the cluster. In order to understand how CO interacts with the active site of native CODHIICh and what function does the bridging mu2S ligand fulfill in the enzyme, this research work focuses (i) on the interaction of cluster C with CO analogue potassium cyanide and analysis of the resulting type of nickel coordination and (ii) on the effect of sodium sulfide on the enzymatic activities of the native CODHIICh. Under catalytic conditions, cyanide acts as a competitive inhibitor of CODHIICh with respect to CO. Under N2 gas phase without electron acceptor (non-catalytic conditions), cyanide inhibits CODHIICh at highly reduced state (low redox-potentials - 500 mV), not at oxidized and slightly reduced (- 320 mV) states. Cyanide is not able to inhibit CODHIICh at reduced conditions (- 500 mV) when CO is present in the atmosphere. Therefore, the interaction of cyanide with reduced active site is expected to mimic the substrate. The binding of cyanide to the nickel ion has been discovered by x-ray absorption spectroscopy and confirmed by x-ray crystallography at the atomic resolution. This structure comprises an intermediate state of cluster C with CO in NiFe-CODHIICh. In this reaction, cyanide displaces the mu2S ligand giving rise to square-planar Ni with three S and one CN ligands. Cluster C and its protein environment undergo significant conformational changes induced by the binding of cyanide. Remarkably, Fe1 is displaced by 1,1 A, which reduces the Fe1 to Ni distance by 0,1 A. Electron densities of the CN ligand estimate an occupancy of 80 % and N atom of cyanide is in hydrogen bonding distance to His93 and Lys563, which are involved in proton transfer network. The binding of cyanide eliminates the bridging ¥ì2S from the cluster C yielding H2S, whereas the Ni-(mu2S)-Fe1 bridge is reformed after the catalytic cycle. It is likely that the high rate of CO oxidation (Kcat/Km of 1.7 x 109 M-1 s-1 at 70 ¡ÆC) and subsequent rebinding of mu2S would prevent the release of this ion from the protein by diffusion-controlled process (108 to 109 M-1 s-1). Cyanide-inhibited reduced CODHIICh is fully reactivated after the release of cyanide upon incubation at 70 ¡ÆC in the presence of low-potential reductants. The square-planar NiS4-coordinated cluster C is recovered by reactivation with sulfide, resulting in fully active enzyme, which includes the reformation of the Ni-(mu2S)-Fe1 bridge. Reactivation in the absence of sulfide generates the NiS3-coordination, lacking the mu2S ligand, and results in partially active enzyme. NiS3-coordinated cluster C is readily converted to NiS4-conformation by incorporation of sulfide. This conversion results in an increase of CO oxidation activity and a stabilization of cluster C at growth temperatures of the bacterium. In addition, the NiS4-conformation displays better catalytic efficiency (Kcat/Km) than NiS3 under low concentrations of CO. Inhibition of CO2 reduction activity by sulfide and higher CO2 reduction activity of NiS3-conformation suggest that the mu2S ligand retards the binding of CO2 to Ni. The crystal structure of CO2 loaded NiS3-cluster further convinces this assumption. The mu2S ligand accelerates the physiologically relevant CO oxidation, prevents inhibition by the product CO2, and inhibits a non-physiological CO2 reduction. These functions of the bridging mu2S are of physiologically importance for the metabolism of C. hydrogenoformans in highly reducing, CO-limited, and CO2-rich volcanic environments. Thus, it is concluded that the [Ni-4Fe-5S]-form of cluster C is the biologically relevant species in CODHIICh. A CO oxidation mechanism developed in this thesis is based on the structures of cyanide-bound intermediated state and CO2-bound state, as well as on the kinetic data on the reactivity of the enzyme with CO, potassium cyanide and sodium sulfide.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Biologie
Author: Seung-Wook Ha
Advisor:Professor Dr. Ortwin Meyer
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:04.05.2009
Year of Completion:2009
SWD-Keyword:Carboxydothermus hydrogenoformans; Kohlenmonoxid-Dehydrogenase
Tag:Carbon monoxide dehydrogenase; metalloenzyme; oxidation of carbon monoxide
Dewey Decimal Classification:500 Naturwissenschaften und Mathematik
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-5545
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):11.05.2009