Synthese von Oligosacchariden der Zellmembran mit neuartigem Verzweigungsmuster und von lipidhaltigen Signalstoffen pflanzlicher Symbionten

Synthesis of cell-surface-oligosaccharides showing a novel branching pattern and of lipid-containing signalling compounds of plant symbionts

Zucker spielen eine entscheidende Rolle in vielen Bereichen des Lebens. Zur Untersuchung ihrer mannigfaltigen biologischen Eigenschaften sind definierte Verbindungen notwendig. Diese Arbeit sollte durch chemo-enzymatische Synthese des von P. Stanley isolierten Lec14-N-Glycans 58, das eine ß-1,2-Verknüpfung von N-Acetyl-glucos-amin mit dem ß-Mannosid des Core-Trisaccharids aufweist, den Strukturvorschlag verifizieren und Neoglycoproteine mit dieser Oligosaccharidstruktur für biologische Studien bZucker spielen eine entscheidende Rolle in vielen Bereichen des Lebens. Zur Untersuchung ihrer mannigfaltigen biologischen Eigenschaften sind definierte Verbindungen notwendig. Diese Arbeit sollte durch chemo-enzymatische Synthese des von P. Stanley isolierten Lec14-N-Glycans 58, das eine ß-1,2-Verknüpfung von N-Acetyl-glucos-amin mit dem ß-Mannosid des Core-Trisaccharids aufweist, den Strukturvorschlag verifizieren und Neoglycoproteine mit dieser Oligosaccharidstruktur für biologische Studien bereitstellen. Zum Aufbau des dazu notwendigen Core-Trisaccharids 39 konnte die Synthese des p-Methoxyphenylbausteins 16 wie auch die reduktive Acetalöffnung von Verbindung 17 deutlich verbessert werden. Die im Rahmen der Core-Trisaccharidsynthese mit den Donoren 24 und 26 durchgeführten Versuche zur direkten ß-selektiven Mannosylierung mit Cyclohexanol als Akzeptor verliefen ß-selektiv und mit sehr hohen Ausbeuten. Mit Chitobiosylazid 30 als Akzeptor wurden Trisaccharide erhalten, allerdings mit geringen Ausbeuten und schlecht abtrennbaren Verunreinigungen. Das Core-Trisaccharid 39 wurde daher durch Inversion aus der Glucoverbindung 38 hergestellt. An Pentasaccharid 41 erfolgte die GlcNAc-ß-1,2-Anbindung an die Mannose des Core-Trisaccharids unter Verwendung des Donors 42. Verschiedene Testreihen führten zum Auffinden eines schmalen Temperaturfensters und zu optimierten Reaktionsbedingungen für die Darstellung des Hexasaccharids 44. Durch Glycosylierung mit dem Disaccharid 40, Donor 51 und anschließender Entschützung wurde das Lec14-Nonasaccharid 54 erhalten. Dieses wurde nach der Kupplung mit Z-Aminohexansäure 55 durch Hydrieren in Verbindung 57 überführt. Verbindung 57 stützte durch Vergleich mit den NMR-Daten von Verbindung 58 den Strukturvorschlag von P. Stanley und stellte das Substrat für enzymatische Synthesen dar. Bei der enzymatischen Galactosylierung wurde jeweils nur ein Äquivalent UDP-Galactose eingesetzt. Dadurch konnten nacheinander die einfach, zweifach und dreifach galactosylierten Verbindungen 61, 62 und 63 erhalten werden. Durch NMR-spektroskopische Untersuchungen wurde eine Selektivität der Galactosyltransferase für den a-1,3-Arm, dann den a-1,6-Arm und schließlich den ß-1,2-Arm gefunden. Auch die Sialylierung aller drei Arme konnte massenspektroskopisch mit Verbindung 64 belegt werden. Da bei Verbindung 57 die Galactosylierung und die anschließende Sialylierung unerwarteterweise an sämtlichen Verzweigungen möglich ist, liegt die Vermutung nahe, dass dieses Strukturmotiv auch bei N-Glycanen der betreffenden CHO-Zellen gefunden werden kann. Durch Anbindung der dreifach galactosylierten Verbindung 63 an Rinderserumalbumin (BSA) steht erstmals mit Neoglycoprotein 66 ein Lec14-Oligosaccharid für biologische Untersuchungen bereit. Im Pflanzenreich sind für eine erfolgreiche Symbiose zwischen Leguminosen und Rhizobien die von den Bakterien sekretierten NOD-Faktoren essentiell. Da Dazzo und Hollingsworth N-Palmitoylglucosamin als Minimalstruktur für NOD-Faktoren ansehen, wurden N-Palmitoylglucosamin 70 und andere Mono-saccharid-derivate für biologische Untersuchungen bereitgestellt. Bei Untersuchungen an Medicago sativa (Luzerne) wurde in Zusammenarbeit mit Herrn K. Niehaus in Bielefeld jedoch nur eine geringe Aktivität der getesteten Verbindungen gefunden, so dass diese nicht als Minimalstrukturen angesehen werden sollten. Der Einfluss der Mono-saccharid-derivate auf die Keimfähigkeit und das Wachstum von Weizen und Mais wurde von Dr. G. Kretzschmar in Frankfurt untersucht. Die z.T. sehr guten Ergebnisse müssen aber aufgrund der hohen Schwankungen bei den biologischen Untersuchungen durch weitere Messreihen abgesichert werden. Für weitere Untersuchungen wurde eine Synthese von natürlichen NOD-Faktoren und Analoga etabliert. Dabei wurde auf die funktionalisierten Monosaccharidbausteine 76 und 78 zurückgegriffen, die in großen Mengen einfach zugänglich sind. Die Aminogruppe des Tetrasaccharids 84 ist für die Kupplung mit Acylresten funktionalisiert. Nach der Kupplung von Acylresten an Verbindung 84 und den anschließenden Entschützungsschritten wurden jedoch Nebenprodukte gefunden, und die Reinigung gestaltete sich aufgrund der sehr geringen Löslichkeit der Verbindungen 94 und 95 sehr schwierig. Ausgehend von Verbindung 84 wurde die freie Aminoverbindung 99 hergestellt. Nach der Kupplung der Acylreste über N-Hydroxysuccinimidester wurden die Zielverbindungen 94 und 95 erhalten. Der Baustein 83 eignete sich für die einfache Darstellung von Analoga. Die Azidofunktion ermöglichte nach der Reduktion zu einem Amin die Anknüpfung von Carbonsäuren am reduzierenden Ende. Die folgende Hydrierung lieferte die Analoga 105 bzw. 106. Die vorgestellte Methode bietet einen leichten Zugang zu NOD-Faktoren und Analoga, deren Einsatz in biologischen Studien weitere Einblicke auf dem Gebiet der NOD-Faktoren und der beteiligten Signalwege bringen soll.show moreshow less
Carbohydrates play a key role in many aspects of life. Well defined carbohydrates are needed to investigate their numerous biological properties. The aim of this work was to synthesize a derivative of the Lec14-N-glycan 58, which has been isolated by P. Stanley. This N-glycan shows a ß-1,2-linkage of N-acetylglucosamine to the ß-mannoside of the core-trisaccharide. The synthetic compound should verify the structural assignments for 58 and allow the preparation of neoglycoproteins for biological Carbohydrates play a key role in many aspects of life. Well defined carbohydrates are needed to investigate their numerous biological properties. The aim of this work was to synthesize a derivative of the Lec14-N-glycan 58, which has been isolated by P. Stanley. This N-glycan shows a ß-1,2-linkage of N-acetylglucosamine to the ß-mannoside of the core-trisaccharide. The synthetic compound should verify the structural assignments for 58 and allow the preparation of neoglycoproteins for biological studies. The synthesis of the p-methoxyphenyl compound 16, which is needed for the synthesis of the core-trisaccharide 39, could be significantly optimized. Additionally, the reductive opening of 17 was improved. To shorten the synthesis of the core-trisaccharide direct ß-mannosylation was investigated. Mannosylation with the donors 24 and 26 and cyclohexanol as an acceptor were ß-selective and afforded the desired product in high yields. When disaccharide 30 was used as an acceptor, only mixtures of trisaccharides were obtained in low yields. Therefore, trisaccharide 39 was synthesized by an inversion strategy using the gluco-configurated compound 38. The pentasaccharide 41 could be coupled with donor 42 to obtain the hexasaccharide 44 with the desired GlcNAc-ß-1,2-linkage. A small temperature range and optimized conditions were found to be crucial for the synthesis of compound 44. Glycosylation of disaccharide 40 with donor 51 and subsequent deprotection yielded the Lec14 nonasaccharide 54. This compound was coupled to Z-aminohexanoic acid 55 and the following catalytic hydrogenation furnished compound 57. Comparison of the NMR-spectra of compound 57 and isolated Lec14 58 allowed the verification of the structural assignments made by P. Stanley. or the enzymatic galactosylation of aminohexanoyl-Lec14 57 only one equivalent UDP-galactose was used per reaction step. This strategy allowed the synthesis of compounds 61, 62 and 63, which were galactosylated once, twice or three times, respectively. By NMR spectroscopy, a preference of the galactosyl transferase could be observed for the a-1,3-arm, followed by the a-1,6 and the ß-1,2-arm. Sialylation of all three branches was observed for compound 64 by electrospray mass spectrometry. The unexpected galactosylation and subsequent sialylation of all the three branches of compound 57 suggests that this structural motif may also be found on N-glycans of the corresponding CHO-cells. Compound 63 containing three galactose residues was used for the synthesis of neoglycoprotein 66 by coupling the carbohydrate moiety via the isothiocyanate derivative 65 to carbohydrate-free BSA. Thus, a neoglycoprotein with the Lec14 nonasaccharide has been provided for the first time for biological testing. For the efficient symbiosis between leguminous plants and rhizobia NOD-factors secreted by the bacteria are essential. Since N-palmitoylglucosamine was considered as a minimal structural requirement for bioactivity by Dazzo and Hollingsworth, N-palmitoyl­glucosamine 70 and other monosaccharide derivatives have been synthesized for biological testing. Testing of the effects on medicago sativa was performed in cooperation with K. Niehaus in Bielefeld and showed only low activity of the tested compounds. Therefore, these compounds should not be considered to contain the minimal structural requirements. The influence of the monosaccharide derivatives on germination and growth of wheat and corn was investigated by Dr. G. Kretzschmar in Frankfurt. The results have to be verified by further testing. For further investigation a synthesis of natural NOD factors and analogues was established. The monosaccharides 76 and 78 used in these syntheses can be prepared in large scale. The aminogroup of tetrasaccharide 84 is suitable for coupling with acylresidues. After the acylation of compound 84 and subsequent deprotecting steps, side products were found. Purification of the final products was very difficult because of the low solubility of compounds 94 and 95. Therefore, amino compound 99 was synthesized starting with compound 84. After acylation via N-hydroxysuccinimide esters, the target compounds 94 and 95 were obtained. Compound 83 is suitable for an easy access to analogues. After reduction of the azido group carboxylic acids were coupled to the reducing end. The final hydrogenation furnished the analogues 105 and 106. Compounds 94, 95, 105 and 106 represent four additional structures, which can be tested for their biological activities regarding the symbiosis between leguminous plants and rhizobia. The presented method offers an easy access to NOD factors and analogues. These can be used in biological studies to gain further information of NOD factors and their signaling pathways.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Ingo Prahl
Advisor:Prof. Dr. Carlo Unverzagt
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:03.06.2002
Year of Completion:2002
SWD-Keyword:Kern-Oligosaccharid; Lipochitin-Oligosaccharide; Mannose; Oligosaccharide
Tag:Lec14; Mannosylierung; N-Glycan; Nod-Faktor
Lec14; N-glycan; lipochitooligosaccharides (LCO's); mannosylation; nodulation
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
RVK - Regensburg Classification:VK 5070
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-100
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):23.12.2002