Strukturelle Untersuchungen an dem Radikalenzym (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase

Structural Investigations on the Radical Enzyme (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA Dehydratase

In der Natur werden viele chemisch schwierige Reaktionen von Radikalenzymen katalysiert. Die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase katalysiert die Dehydratisierung von (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA in der Fermentation von L-Leucin im humanpathogenen Bakterium Clostridium difficile. Im Gegensatz zu einer Vielzahl von Radikalenzymen, wie beispielsweise der Coenzym B12-abhängigen bakteriellen Klasse II Ribonukleotid-Reduktase oder der S-Adenosylmethionin-abhängigen Biotin-Synthase, benötigt die (R)In der Natur werden viele chemisch schwierige Reaktionen von Radikalenzymen katalysiert. Die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase katalysiert die Dehydratisierung von (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA in der Fermentation von L-Leucin im humanpathogenen Bakterium Clostridium difficile. Im Gegensatz zu einer Vielzahl von Radikalenzymen, wie beispielsweise der Coenzym B12-abhängigen bakteriellen Klasse II Ribonukleotid-Reduktase oder der S-Adenosylmethionin-abhängigen Biotin-Synthase, benötigt die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase keine komplexen Kofaktoren zur Erzeugung des katalytisch aktiven Radikals. Stattdessen verwendet sie ein einzelnes, hoch energetisches Elektron. Bei der Dehydratisierung – einer atypischen α/β-Eliminierung – werden reduktiv Ketylradikale im Substrat erzeugt. Die Dehydratase muss zunächst aktiviert werden, indem ein Aktivator, der ein [4Fe-4S]-Zentrum enthält, unter ATP-Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase überträgt. Für den Aktivator werden im Laufe des Aktivierungsprozesses Nukleotid- und redox-abhängige Konformationsänderungen angenommen. Das hoch reaktive Elektron wird nach jedem Substratumsatz wieder auf die Dehydratase übertragen, so dass bis zu 10.000 Umsätze katalysiert werden können, bevor eine erneute Aktivierung notwendig ist. Die strukturelle Grundlage der Aktivierung sowie die Art und Weise, wie das aktive Elektron in der Dehydratase nach erfolgtem Umsatz wiedergewonnen und vor Verlust durch unspezifische Nebenreaktionen geschützt wird, ist unbekannt. In dieser Arbeit konnte zunächst die Struktur der homodimeren (E)-2-Isocaprenoyl-CoA:2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase gelöst werden, die in der Fermentation von L-Leucin den zweimaligen Transfer eines Coenzym A-Moleküls katalysiert. Sie gehört zur Familie III der CoA-Transferasen und besitzt deren typische Faltung. Ein Aspartatrest im aktiven Zentrum ist wahrscheinlich an der Ausbildung von kovalenten Intermediaten beteiligt. Es wurden die Strukturen des reduzierten Aktivators ohne Nukleotid, mit ADP und mit dem ATP-Analogon ADPNP bestimmt. Der homodimere Aktivator gehört zur Actin-Faltungsfamilie und die Monomere sind durch ein verbrückendes [4Fe-4S]-Zentrum miteinander verbunden. Jedes Monomer besteht aus zwei Domänen, die in Abwesenheit eines Nukleotids eine offene und in Gegenwart eines Nukleotids eine geschlossene Konformation einnehmen. Die Strukturen des reduzierten Aktivators mit gebundenem ADP und ADPNP zeigten keine signifikaten Konformationsunterschiede. Der Vergleich mit der Struktur eines oxidierten Aktivators ergab, dass auch die Reduktion des [4Fe-4S]-Zentrums offenbar keine strukturellen Änderungen zur Folge hat. Möglicherweise spiegeln die Strukturen, die alle mittels Röntgenkristallographie bestimmt wurden, jedoch nicht die konformationelle Flexibilität in Lösung wider. Erstmals wurde die Komplexbildung zwischen dem Aktivator und der Dehydratase mittels ADPNP nachgewiesen. Die Strukturen des Aktivators legen nahe, dass die Komplexildung über den Prozess der konformationellen Selektion geschieht. Die Struktur der Dehydratase zeigte, dass das heterodimere Protein zwei [4Fe-4S]-Zentren in einem Abstand von 12 Å beinhaltet. Jedes Fe/S-Zetrum ist von drei Cysteinresten und einem terminalen Liganden koordiniert. Das Fe/S-Zentrum in der α-Untereinheit ist Teil des aktiven Zentrums und besitzt in Abwesenheit von Substrat ein Hydroxyidion/Wassermolekül als vierten Liganden. Das Substrat ersetzt diesen Liganden und koordiniert das Fe/S-Zentrum mit dem Carbonylsauerstoffatom der Thioestergruppe. Das [4Fe-4S]-Zentrum in der β-Untereinheit hat eine Sulfhydryl-/Sulfidogruppe als terminalen Liganden und fungiert als Speicher für das Elektron, wenn kein Substrat anwesend ist. Die Struktur der (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase dient als Modell für die Familie der 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen und der Gruppe der phylogenetisch verwandten Benzoyl-CoA-Reduktasen.show moreshow less
In nature many chemically challenging reactions are catalyzed by radical enzymes. (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase catalyzes the dehydration of (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA during the fermentation of L-leucine in the human pathogenic bacterium Clostridium difficile. In contrast to other radical enzymes, such as coenzyme B12-dependent bacterial class II ribonucleotide reductase or S-adenosylmethionine-dependent biotin synthase, (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase requires no complex cofIn nature many chemically challenging reactions are catalyzed by radical enzymes. (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase catalyzes the dehydration of (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA during the fermentation of L-leucine in the human pathogenic bacterium Clostridium difficile. In contrast to other radical enzymes, such as coenzyme B12-dependent bacterial class II ribonucleotide reductase or S-adenosylmethionine-dependent biotin synthase, (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase requires no complex cofactors for radical generation, but uses a single high-energy electron instead. During the dehydration reaction – an atypical α/β-elimination – ketyl radicals are generated reductively on the substrate. First, a [4Fe-4S] cluster containing activator must activate the dehydratase by transferring an electron to the dehydratase concomitant with the hydrolysis of ATP. Nucleotide- and redox-dependent conformational changes of the activator during the activation process are assumed. After each turnover the highly reactive electron is recycled back to the dehydratase allowing up to 10,000 turnovers before a new activation is necessary. The structural basis for the activation process as well as for the recycling of the electron in the dehydratase and for the mechanism of how the loss of the active electron by unspecific side reactions is prevented in the dehydratase is unknown. In this work, the structure of the (E)-2-isocaprenoyl-CoA:2-hydroxyisocaproate CoA transferase was solved. This enzyme catalyzes the transfer of a coenzyme A molecule twice in the fermentation pathway of L-leucine. The homodimeric transferase belongs to the family III of CoA transferases and an aspartate residue in the active site is probably involved in catalysis by forming covalent intermediates. The crystal structures of the reduced activator without nucleotide, with ADP and with the ATP analog ADPNP were determined. The homodimeric activator is a member of the actin fold family and the monomers are connected via a bridging [4Fe-4S] cluster. Each monomer is composed of two domains, which adopt an open conformation in the absence of a nucleotide and a closed conformation when a nucleotide is present. The exchange of ADP by ADPNP does not lead to significant conformational changes. A comparison with an oxidized activator revealed that reduction of the Fe/S cluster has also no structural consequences. However, it is possible that the crystal structures do not reflect the conformational flexibility in solution. For the first time, complex formation between activator and dehydratase was observed in the presence of ADPNP. The crystal structures indicate that complex formation probably proceeds via a process called conformational sampling. The structure of the dehydratase reveals that the heterodimeric protein harbors two [4Fe-4S] clusters at a distance of 12 Å. Each cluster is coordinated by three cysteine residues and a terminal ligand. The Fe/S cluster in the α-subunit is part of the active site and has a hydroxide ion or water molecule as fourth ligand in the absence of substrate. When substrate enters the active site it replaces the water ligand and coordinates the Fe/S cluster via its carbonyl oxygen of the thioester. The [4Fe-4S] cluster in the β-subunit has a sulhydryl/sulfido group as the terminal ligand und serves as a storage for the electron in the absence of substrate, thus preventing unwanted side reactions. The structure of (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase is a model for the family of 2-hydroxyacyl-CoA dehydratases and the phylogenetically related benzoyl-CoA reductases.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Stefan Knauer
Advisor:Prof. Dr. Holger Dobbek
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:15.12.2011
Year of Completion:2011
SWD-Keyword:Aktivatorproteine; Clostridium difficile; Dehydratisierung; Eisen-Schwefel-Proteide; Elektronentransportkette
Tag:2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase; ATPase; Elektronenrecycling; Ketylradikal; Radikalenzym
2-Hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase; ATPase; electron recycling; ketyl radical; radical enzyme
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-9583
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):08.02.2012