Charakterisierung thermophiler Cellulasen aus Sulfolobus solfataricus und Thermotoga maritima

Characterization of thermophilic celluases from Sulfolobus solfataricus and Thermotoga maritima

Die Cellulase SSO1949 aus dem hyperthermophilen Archaeon S. solfataricus P2 ist aufgrund ihrer extremen thermo- und acidophilen Eigenschaften interessant für industrielle Anwendungen. 2005 wurde das 37 kDa grosse Enzym biochemisch charakterisiert und weist ein pH- und Temperaturoptimum von ca. 1.8 und ca. 80°C auf. Auf ein N-terminales Signalpeptid folgt eine Ser/Thr-reiche Region, an welche die katalytische Domäne anschliesst, die Sequenzähnlichkeiten zu anderen Mitgliedern der GlykosidhydrolasDie Cellulase SSO1949 aus dem hyperthermophilen Archaeon S. solfataricus P2 ist aufgrund ihrer extremen thermo- und acidophilen Eigenschaften interessant für industrielle Anwendungen. 2005 wurde das 37 kDa grosse Enzym biochemisch charakterisiert und weist ein pH- und Temperaturoptimum von ca. 1.8 und ca. 80°C auf. Auf ein N-terminales Signalpeptid folgt eine Ser/Thr-reiche Region, an welche die katalytische Domäne anschliesst, die Sequenzähnlichkeiten zu anderen Mitgliedern der Glykosidhydrolase-Familie 12 aufweist. Für biotechnologische Anwendungen muss SSO1949 möglichst kostengünstig in grossen Mengen produziert werden. In E. coli wird SSO1949 rekombinant in unlöslicher Form („Inclusion Bodies“) überexprimiert. Die Aggregation des Proteins konnte auch durch Koexpression mit Chaperonen, Verkürzung der Ser/Thr-reichen Region sowie des C-Terminus, Deletieren des hydrophoben Loops innerhalb der konservierten Region und Fusion mit verschiedenen Proteinen nicht verhindert werden. In dieser Arbeit wurde eine Strategie entwickelt, SSO1949 aus „Inclusion Bodies“ denaturierend zu reinigen und das inaktive Enzym anschliessend in seine aktive Form zu überführen. Das geschah durch schnelles Verdünnen des Proteins in Rückfaltungspuffer. Die anschliessende Aufkonzentrierung gestaltete sich schwierig, dennoch konnte SSO1949 in dieser Arbeit enzymatisch charakterisiert werden. Im katalytischen Zentrum von SSO1949 befinden sich zwei konservierte Glutamatreste (E213 und E310). Durch Modellstrukturanalysen konnten in der Umgebung der katalytischen Reste Aminosäuren identifiziert werden, die möglicherweise für die extreme Acidophilie von SSO1949 verantwortlich sind. Durch gezielten Austausch dieser Aminosäuren wurde untersucht, inwiefern das pH-Optimum des Enzyms verschoben werden kann. Den grössten Einfluss zeigte die Mutation der Aminosäure Threonin 137 zu Asparagin, bei der sich das pH-Optimum von SSO1949 von 1.8 auf 3.4 verschob. Dieser Effekt konnte bereits bei Mutation der homologen Aminosäuren in Xylanasen von in Aspergillus kawachii, Streptomyces sp. und Bacillus circulans beobachtet werden. Da sich E. coli nicht als geeignetes Expressionssystem für SSO1949 herausstellte, wurde in dieser Arbeit dazu übergegangen, das Enzym unter den Bedingungen zu exprimieren, unter denen es natürlicherweise exprimiert wird, nämlich in dem Crenarchaeot Sulfolobus. Seit 2007 steht für Sulfolobus acidocaldarius ein Shuttle-Vektor-System zur Verfügung, in welchem SSO1949 unter Kontrolle verschiedener induzierbarer und konstitutiver Promotoren exprimiert wurde. Darüberhinaus wurde SSO1949 zur stabileren Proteinexpression auch ins Genom von S. acidocaldarius integriert. Durch Verwendung von uracilauxotrophen pyrEF-defizienten Mutanten wurde eine effiziente Selektion erreicht. Als selektive Marker für die Uracil-Selektion dienten die funktionsfähigen pyrEF-Gene aus Sulfolobus solfataricus P2, welche für Enzyme des Uridinmonophosphat-Syntheseweges codieren. SSO1949 zeigt 85% Sequenzidentität zu einer weiteren Endoglukanase aus Sulfolobus solfataricus. Bei der Cellulase SSO1354 handelt es sich um eine extrazelluläre Cellulase, die nicht frei ins Medium sekretiert wird, sondern mit der Zelloberfläche assoziiert bleibt. Auch SSO1949 ist sowohl in der Membranfraktion als auch im Kulturüberstand zu finden und kann aus beiden Fraktionen aufgereinigt werden. Die Aufeinigung von SSO1949 gestaltete sich schwierig und seine Identität konnte nicht massenspektrometrisch bestätigt werden. Aufgrund von Sequenzähnlichkeiten zu SSO1949 wurden zwei weitere Cellulasen der Glykosidhydrolase-Familie 12 für Mutationsstudien im aktiven Zentrum ausgewählt. CelA aus Thermotoga maritima und EglA aus Pyrococcus furiosus wurden bereits in früheren Arbeiten charakterisiert und weisen ebenfalls extreme Hitzestabilität auf mit einem pH-Optimum im leicht sauren Bereich bei pH 6. Durch gezielten Austausch von Aminosäuren im katalytischen Zentrum der beiden Glukanasen gegen die homologen Aminosäuren in SSO1949 sollte ihr pH-Optimum weiter ins saure Milieu verschoben werden. Die Punktmutationen im aktiven Zentrum von CelA führten jedoch lediglich zu einer Verschiebung des pH-Optimums um eine pH-Stufe in den sauren Bereich. Bei allen Mutanten wurde die cellulolytische Aktivität in Mitleidenschaft gezogen. Abschließend wurde ein Hybridprotein aus den beiden Cellulasen SSO1949 aus Sulfolobus solfataricus und CelA aus Thermotoga maritima generiert, welches die Eigenschaften der besseren Löslichkeit und Acidophilie erfolgreich in einem Protein vereint. Das neu entstandene Fusionsprotein wird zwar noch immer unlöslich in E. coli exprimiert, kann jedoch im Gegensatz zu SSO1949 mit milderen Denaturierungsmitteln aus „Inclusion Bodies“ gelöst werden. Nach erfolgreicher Rückfaltung zeigte das funktionsfähige Hybridprotein ein Temperaturoptimum von ca. 85°C und ein pH-Optimum von ca. pH 3.show moreshow less
The cellulase SSO1949 from the hyperthermophilic archaeon S. solfataricus P2 is optimally adapted to work under acidic conditions and high temperatures and is therefore an interesting enzyme for industry and biotechnology. The enzyme with a molecular mass of 37 kDa was biochemically characterized in 2005 and shows a pH-optimum at approximately 1.8 as well as a temperature optimum at approximately 80°C. The protein consists of an N-terminal signal peptide, a Ser/Thr-rich region and a catalytic doThe cellulase SSO1949 from the hyperthermophilic archaeon S. solfataricus P2 is optimally adapted to work under acidic conditions and high temperatures and is therefore an interesting enzyme for industry and biotechnology. The enzyme with a molecular mass of 37 kDa was biochemically characterized in 2005 and shows a pH-optimum at approximately 1.8 as well as a temperature optimum at approximately 80°C. The protein consists of an N-terminal signal peptide, a Ser/Thr-rich region and a catalytic domain which shows significant homology to cellulases of glycoside hydrolase family 12. For biotechnological applications SSO1949 has to be produced in large scale. When SSO1949 is expressed in E. coli, it is insoluble and the solubility of the protein couldn’t be enhanced by coexpression with chaperones, shortening of the Ser/Thr-rich region and the C-terminal end, deletion of a hydrophobic loop within the catalytic domain or fusion with different proteins. In this work, a strategy was developed to purify inactive SSO1949 under denaturing conditions from inclusion bodies and to convert the enzyme into its active form. This was done by rapidly diluting the protein in refolding buffer. The subsequent concentration was difficult. Nevertheless, SSO1949 was enzymatically characterized in this work and the temperature as well as the pH optimum were confirmed. The catalytic center of SSO1949 is formed by two conserved glutamic residues (E213 and E310). Model structure analysis identified amino acids in the environment of the catalytic residues which may be important for the extreme acidophilicity of SSO1949. Replacements of amino acids surrounding the two glutamic acids should clarify how they are involved in the acidophilic adaption. The mutation of threonin 137 to asparagine showed the biggest influence on the pH optimum. The pH optimum was shifted from 1.8 to 3.4. This effect has already been observed in xylanases of Aspergillus kawachii, Streptomyces sp. and Bacillus circulans when the homologous amino acid was mutated. Because E. coli is not the appropriate expression system for SSO1949 we decided to express the enzyme in the crenarchaeot Sulfolobus, the organism in which it is naturally expressed. The genus Sulfolobus is one of the best studied archaeal organisms and it offers appropriate genetic systems for expression of proteins. Several Sulfolobus shuttle vector systems are available and since 2007 also for Sulfolobus acidocaldarius. SSO1949 was expressed under the control of different inducible and constitutive promoters. In addition SSO1949 was integrated into the genome of S. acidocaldarius for more stable protein expression. Efficient selection could be achieved by use of uracil auxotrophic pyrEF deficient recipient strains. The intact pyrEF genes from Sulfolobus solfataricus P2 encoding enzymes from Uridinmonophosphat synthetic pathway were used as selectable markers. SSO1949 shows 85% sequence identity to SSO1354, another endoglucanase from Sulfolobus solfataricus, which has already been successfully purified from Sulfolobus. SSO1354 seems to be an extracellular cellulase. In fact, it was shown that it is not freely released in the culture media but associated with the cellsurface. In the stationary phase SSO1949 could also be detected in the membrane fraction and in the supernatant of a Sulfolobus culture. Therefore SSO1949 was purified from the membrane fraction and the culture supernatant. The purification of SSO1949 was difficult and its identity could not be confirmed by mass spectrometry. On the basis of sequence similarities to SSO1949 two other cellulases of the glycoside hydrolase family 12 were selected for mutational studies at the active site. CelA from Thermotoga maritima and EglA from Pyrococcus furiosus have been characterized in previous studies and showed also extreme heat stability but in contrast to SSO1949 a pH optimum at pH 6. In this work substitutions of amino acids in the catalytic center of the two glucanases against the homologous amino acids in SSO1949 should clarify if their pH optimum can be shifted into the acidic range. The point mutations at the active site of CelA resulted in a shift of the pH optimum of one pH level into the acidic region, but the cellulolytic activity of all mutants decreased. In the last part of this study we constructed a hybrid protein of the cellulases SSO1949 from Sulfolobus solfataricus and CelA from Thermotoga maritima. The hybrid protein successfully combined the properties of better solubility and acidophilicity. It is still expressed insolubly in E. coli, although it can be purified from inclusion bodies using mild denaturants. After refolding the functional hybrid shows a temperature optimum of approximately 85°C and a pH optimum of approximately pH 3.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Kristina Kufner
Advisor:Prof. Dr. Georg Lipps
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:08.03.2011
Year of Completion:2010
SWD-Keyword:Cellulasen; Rückfaltung; Shuttle-Vektor; Sulfolobus; Thermotoga
Tag:cellulase; hybrid protein; shuttle vector
Dewey Decimal Classification:500 Naturwissenschaften und Mathematik
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-8470
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):19.04.2011