Komplexe des Prion Proteins mit antiprional wirksamen Substanzen

Complexes of the prion protein with anti prion active substances

Prionerkrankungen gehören zur Klasse der neurodegenerativen Erkrankungen, in deren Verlauf sich das Prion Protein (PrP) von einer zellulären in eine pathogene Konformation umwandelt. Sie verlaufen letal und eine Therapie ist trotz intensiver Forschung bisher nicht verfügbar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Interaktionsflächen von zellulärem Prion Protein (PrPc) mit möglichen Wirkstoffen strukturell zu beschreiben. Die hierzu untersuchten Peptide und kleinen organischen VerbindungePrionerkrankungen gehören zur Klasse der neurodegenerativen Erkrankungen, in deren Verlauf sich das Prion Protein (PrP) von einer zellulären in eine pathogene Konformation umwandelt. Sie verlaufen letal und eine Therapie ist trotz intensiver Forschung bisher nicht verfügbar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Interaktionsflächen von zellulärem Prion Protein (PrPc) mit möglichen Wirkstoffen strukturell zu beschreiben. Die hierzu untersuchten Peptide und kleinen organischen Verbindungen, welche als antiprionwirksam beschrieben worden sind, interagierten aber nicht oder nur in einem Maß, welches eine detaillierte Strukturuntersuchung nicht ermöglicht hätte. Hingegen konnte gezeigt werden, dass der organische Wirkstoff 293G02, der an die Scrapie-Form des Prion Proteins bindet, auch mit PrPc interagiert. Für die physiologisch relevante und auch krankheitsassoziierte Oktarepeat-Region (4OR) war bekannt, dass diese kupferabhängig an PrP binden kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein NMR-Schnelltest modifiziert, um die Versuchsbedingungen für NMR-Interaktionsstudien von PrP und 4OR zu optimieren. Trotz Verwendung eines gut löslichen Fusionspartners konnten NMR-Studien wegen mangelnder Löslichkeit im relevanten pH-Bereich nicht erfolgen. Es gelang aber, Bedingungen zu finden, unter denen Kristalle mit gebundenem Kupfer für die Röntgenstrukturanalyse präpariert werden konnten. Schwerpunkt dieser Arbeit war die strukturbiologische Charakterisierung des therapeutisch aktiven Einzelstrangantikörpers W226. Dieser bindet an Helix 1 aus PrPc mit nanomolarer Dissoziationskonstante und kann persistent scrapieinfizierte Zellkulturen heilen. Anhand verschiedener biophysikalischer Methoden, insbesondere Fluoreszenz- und NMR-Spektroskopie, wurden das Epitop und die entsprechende Bindungsstelle am Antikörper untersucht. Für das Epitop konnten die Positionen Y145, R148 und E152 mittels eines fluoreszenzbasierten Alanin-Scans als essenziell bestimmt werden. Diese bilden unter Einbezug benachbarter Positionen ein strukturelles Epitop, welches durch seine Dichte von geladenen und polaren Gruppen besticht. Die Daten implizieren eine, auf der Abschirmung von für die Umfaltung relevanten Positionen beruhende, antiprionale Wirkung. Trotz der für die NMR-Spektroskopie anspruchsvollen Größe von 33 kDa konnten für den scFv W226 alle relevanten mehrdimensionalen Spektren aufgenommen und so eine strukturelle Charakterisierung vorgenommen werden. Möglich wurde dies durch die Kombination verschiedener Markierungsmethoden, die eine Dreifachmarkierung und die mehrfache aminosäurespezifische selektive Markierung einschloss. Ergänzend wurden Messungen zur Bestimmung oberflächenexponierter Positionen mittels einer löslichen, paramagnetischen Spinsonde durchgeführt. Alle Messungen wurden jeweils in Ab- und Anwesenheit des Epitops durchgeführt. W226 besitzt im Bereich der variablen Regionen einige für Antikörper relativ große Schleifen, die im freien Zustand zu internen Bewegungen auf der mittleren NMR-Zeitskala führen, welche in weiterer Folge eine eindeutige Zuordnung im epitopbindenden Bereich mit den heteronuklearen 3D-NMR-Spektren verhinderten. Dennoch konnten 144 von 311 Resten eindeutig zugeordnet werden. Diese liegen in zusammenhängenden, strukturbildenden Bereichen des Antikörperfragments rund um das Paratop und erlaubten die Verifizierung von Homologiemodellen. Mittels deutlich empfindlicheren zweidimensionaler 15N-Korrelationsspektren des freien und epitopgebundenen Zustands in Kombination mit ausgewählten aminosäuretypselektiv 15N-markierten Proben, die mit Hinblick auf die Verteilung bestimmter Aminosäuretypen in den variablen Bereichen des Antikörperfragments erfolgte, konnte anhand mehrdeutiger Zuordnungen gezeigt werden, dass alle sechs variablen Schleifen zur Bindung des Epitops beitragen, wobei die variable Schleife 3 der leichten Kette nur einen untergeordneten Beitrag leistet. In Verbindung mit den gegen die NMR-Daten verifizierten Homologiemodellen und dem zuvor bestimmten strukturellen Epitop konnten diese Informationen in Docking-Simulationen verwendet und ein erstes Modell für den Komplex aus W226 und PrPc erstellt werden. Helix 1 bindet dabei parallel in eine Furche, die aus den variablen Schleifen gebildet wird. Somit wird eine große Kontaktfläche geschaffen, die Wechselwirkungen zwischen aromatischen und polaren Resten, sowie Salzbrücken zwischen Antikörper und Antigen aufweist. Das Modell unterstützt den hier vorgeschlagenen Mechanismus für die antiprionale Wirksamkeit, nämlich der Abschirmung von für die pathogene Konformationsumwandlung wichtigen Resten in PrPc. Gleichzeitig bildet es die Grundlage für Protein-Engineering am Antikörper zur weiteren Verbesserung der Bindungskonstante von W226. Es ermöglicht auch Studien zum Design kleiner organischer Wirkstoffmoleküle, welche an Helix 1 binden und dabei die Kontaktoberfläche der epitopbindenden Regionen aus W226 imitieren.show moreshow less
Prion diseases are a class of neurodegenerative diseases, which are caused by a lethal conformational change of the cellular form into the infectious isoform. There is no cure available at present. This work aims to characterize the interaction surface of cellular prion protein (PrPc) in complex with lead structures for anti prion compounds. Interaction studies with small molecule ligands and peptides yielded only weak binders or resulted in no binding at all. For the physiological relevant and Prion diseases are a class of neurodegenerative diseases, which are caused by a lethal conformational change of the cellular form into the infectious isoform. There is no cure available at present. This work aims to characterize the interaction surface of cellular prion protein (PrPc) in complex with lead structures for anti prion compounds. Interaction studies with small molecule ligands and peptides yielded only weak binders or resulted in no binding at all. For the physiological relevant and also disease related copper binding octarepeat region conditions could be obtained, allowing to gain crystals in a copper bound state for x-ray diffraction measurements. This work was focused on the detailed characterization of the therapeutic active single chain antibody W226, which binds with nanomolar affinity to helix 1 of the prion protein and is able to cure persistent scrapie infected cell lines. The antibody and its epitope could be analysed by biophysical methods. By a fluorescence-based alanine-scan, Y145, R148 and E152 were identified as essential amino acids for antibody binding. These residues form, along with adjacent positions, a structural highly charged, polar interface. The results imply an anti prion mechanism based upon shielding of positions essential for prion propagation. Despite the large molecular weight of the antibody (33 kDa), all NMR-spectra relevant for the backbone assignment could be recorded. Thus, structural characterization of W226 was possible. This was obtained by a combination of triple isotopic labelling, selective l5N-labelling of amino acids and a spin label study, carried out in presence and absence of an epitope-representing peptide. Due to internal dynamics on the micro to millisecond time scale for the complementarity determining regions (CDRs), no assignment could be achieved for this region. Nevertheless, 144 out of 311 residues could be assigned. The assigned positions are located in the CDR-stabilising scaffold of the antibody and allow confirming the established homology-model for scFv W226. Using more sensitive 2D-HSQC-spectroscopy, combined with a selective labelling strategy adjusted to the fractional aa-distribution in the CDRs, it could be shown that all CDRs are involved in epitope binding, whereas CDR 3 of the light chain plays a minor role. All data obtained allow a first model for the complex of PrPc and scFv W226. In this model, PrP-helix 1 is deeply buried in the binding groove formed by the CDRs of the antibody. The complex is stabilized by interactions of aromatic and polar amino acids as well as by intermolecular salt bridges. Our model also supports the hypothesized anti prion mechanism based upon shielding of positions essential for transformation of PrPc. Simultaneously the model represents an important prerequisite for engineering of high affinity antibodies. It also allows design of tailored anti prion compounds mimicking the contact surface of W226.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Christian Mangels
Advisor:PD Dr. Stephan Schwarzinger (PD Dr.)
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:09.05.2008
Year of Completion:2008
SWD-Keyword:Antikörper; NMR-Spektroskopie; Prionprotein; Wirkstoff
Tag:Einzelstrang-Antikörper; Leitstruktur-Suche; Strukturbiologie; Wirkstoff-Design
NMR-spectroscopy; drug design; ligand binding; prion protein; single-chain antibody
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-4416
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):06.02.2009