In vitro-Selektion am lentiviralen Transaktivator-Protein aus HIV-1

In vitro selection on the lentiviral transactivating protein of HIV-1

In der vorliegenden Arbeit konnte für das lentivirale Transaktivatorprotein HIV-1-Tat ein ternäres Phagen-Display-System etabliert werden. Die Bindung von phagenpräsentiertem HIV-Tat an HIV-TAR-RNA erfolgt im Phagen-Display nur mit geringer Affinität. Durch die Erweiterung des Tat-TAR-Phagen-Displays mit dem zellulären Kofaktor Cyclin T1 konnte die Affinität und Spezifität der Bindung von HIV-Tat an HIV-TAR-RNA gesteigert werden. Somit konnte zum ersten Mal der in vitro und in vivo dokumentierteIn der vorliegenden Arbeit konnte für das lentivirale Transaktivatorprotein HIV-1-Tat ein ternäres Phagen-Display-System etabliert werden. Die Bindung von phagenpräsentiertem HIV-Tat an HIV-TAR-RNA erfolgt im Phagen-Display nur mit geringer Affinität. Durch die Erweiterung des Tat-TAR-Phagen-Displays mit dem zellulären Kofaktor Cyclin T1 konnte die Affinität und Spezifität der Bindung von HIV-Tat an HIV-TAR-RNA gesteigert werden. Somit konnte zum ersten Mal der in vitro und in vivo dokumentierte Einfluss eines Kofaktors in einem Phagen-Display-System reproduziert werden. Bereits durch erste funktionelle Tests des ternären Phagen-Display-Systems konnte gezeigt werden, dass der Verlust der basischen Aminosäuren der basischen Sequenzdomäne von HIV-Tat keine negative Auswirkung auf die Wechselwirkung zwischen Cyclin T1 und HIV-Tat hat. Für die weitere Untersuchung der Rolle der Aminosäuren der basischen Sequenzdomäne wurden voneinander unabhängige Tat-random-Bibliotheken konstruiert, in denen die Aminosäurepositionen R49, K50, K51, R52 bzw. die Aminosäurepositionen R53, R55, R56, R57 vollständig randomisiert wurden. Zusätzlich wurde eine Tat-C31S-random-Bibliothek basierend auf der Mutante Tat-C31S konstruiert, in der die Randomisierung an den Positionen R53, R55, R56, R57 erfolgte. Die Bibliotheken erwiesen sich mit einer Anzahl an unabhängigen Klonen zwischen 1,1 x 106 und 1,5 x106 als ausreichend divers für eine Selektion. Das Selektionssystem ermöglicht die Anreicherung von Tat-Varianten, die tatsächlich unter den gegebenen Selektionsbedingungen d.h. in Anwesenheit oder Abwesenheit von Cyclin T1 an TAR-RNA binden. Tat-wt wurde in keiner der Selektionen angereichert. Ebenso wurde keine Präferenz für basische Aminosäuren erhalten. Sie scheinen für die Bindung von HIV-Tat an TAR-RNA nicht notwendig zu sein. Alle selektierten Tat-Varianten besitzen die Fähigkeit, einen ternären Tat-TAR-Cyclin T1-Komplex auszubilden. Alle charakterisierten Tat-Varianten besitzen in vivo Transaktivierungsaktivität, die mit der Lokalisation der Tat-Variante in der Zelle korreliert ist. Tat-Varianten, die ausschließlich im Kern lokalisieren, weisen die größte Aktivität auf, während Tat-Varianten, die nur in geringem Maß in die Zelle gelangen auch nur eine geringe Aktivität aufweisen. Die Anhäufung von Argininen und Lysinen innerhalb eines Peptides übt keinen entgegengesetzten Selektionsdruck aus. Dies konnte durch die Selektion einer Ph.D.12-Peptidbibliothek nachgewiesen werden. Unter verschiedenen Selktionsbedingungen konnten Peptide selektiert werden, die mit verschiedenen Affinitäten und Spezifitäten TAR-RNA binden. Unter unspezifischen Bedingungen konnte ein Peptid mit einer großen Anzahl an basischen Aminosäuren gefunden werden, welches hochaffin aber unspezifisch an TAR-RNA bindet. Im Gegensatz dazu wurden unter spezifischen Bedingungen Peptide gefunden, die mit hoher Affinität spezifisch an TAR-RNA binden. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein ternäres Phagen-Display-System für die Untersuchung von Protein-RNA Wechselwirkungen genutzt. Damit gelang es, Aufschluss über die Bedeutung der basischen Sequenzdomäne von HIV-1-Tat für die Bindung an TAR RNA zu erhalten.show moreshow less
In the present work a ternary phagedisplay system suitable for the lentiviral transactivating protein Tat of HIV-1 was established. Binding of phage displayed HIV-Tat to TAR RNA results only in low affinity. The Tat phage display system was upgraded with the cellular cofactor cyclin T1 which increases the affinity and specifity of Tat-TAR interaction. Thus, it was the first time that the in vitro and in vivo described influence of a cofactor was imitated by a phage display system. Functional stuIn the present work a ternary phagedisplay system suitable for the lentiviral transactivating protein Tat of HIV-1 was established. Binding of phage displayed HIV-Tat to TAR RNA results only in low affinity. The Tat phage display system was upgraded with the cellular cofactor cyclin T1 which increases the affinity and specifity of Tat-TAR interaction. Thus, it was the first time that the in vitro and in vivo described influence of a cofactor was imitated by a phage display system. Functional studies of the ternary phage display system have already shown, that removal of all basic residues of the basic sequence domain of HIV-Tat does not negatively effect the Tat-cyclin T1 interaction. For further studies to investigate the role of amino acid residues of the basic sequence domain independent Tat-random libraries were constructed. Either sequence positions R49, K50, K51, R52 or R53, R55, R56, R57 were completely randomized. Besides a Tat-C31S-random library based on a Tat-C31S mutant was constructed in which the sequence positions R53, R55, R56, R56 were completeley randomized. Libraries containing a number of 1,1 x 106 and 1,5 x106 independent clones were sufficient for selection. The selection system makes the enrichment of Tat-variants possible, which are actually able to bind TAR RNA under the given selectio conditions which means in the Ppresence or absence of cyclin T1. No selection procedure leads to the enrichment of Tat-wt, just as there were no preference for basic residues. The basic residues seems not to be important for binding of HIV-Tat to TAR RNA. All selected Tat-variants were able to form a ternary complex existing of Tat, TAR and cyclin T1. All of the characterized Tat-variants have in vivo transactivating activity, which is connected with the localisation of the corresponding Tat-variant. Highest activity was found for Tat-variants that localisate only in the nucleus, whereas Tat-variants with low activity get only to a slight portion into the nucleus. Accumulation of arginine and lysine within a peptide does not lead to a opposite selection pressure. Tjis was shown by selestion of a Ph.D.12-peptide library. With different selection conditions it was able to select peptides that binds with different affinity and specifity to TAR RNA. Specific conditions leads to a peptide with a high number of basic residues which bind with high affinity but no specifity to TAR RNA. In contrast, specific conditions leads to peptides they bind with high affinity and specifity to TAR RNA. In the present work it was the first time for using a ternary phage display system to investigate protein-RNA interactions. With this system it was possible to obtain information about the role of the basic sequenc domain of HIV-Tat for the binding to TAR RNA.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Biologie
Author: Gesa Jonas
Advisor:Prof. Dr. Dieter Willbold
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:27.05.2002
Year of Completion:2002
SWD-Keyword:HIV
Tag:HIV-Tat; Phagen-Display; RNS-Bindungsproteine; ternäres Phagen-Display-System
HIV; HIV-Tat; Phage display; protein-RNA interaction; ternary phagedisplay system
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-179
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):17.01.2003