Intact and Damaged DNA and their Interaction with DNA-Binding Proteins: a Single Molecule Approach

Intakte und geschädigte DNS und ihre Wechselwirkungen mit DNS-bindenden Proteinen: Messungen an Einzelmolekülen

In the present work we study the architecture of intact and damaged DNA and their interaction with DNA-binding proteins using a combination of atomic force microscopy (AFM) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS). In the beginning of this scientific work we therefore focus our efforts on the development of a reproducible protocol for the surface-deposition of different biomolecules, such as linear and circular DNA, different types of proteins and DNA-protein complexes. The analysis of thIn the present work we study the architecture of intact and damaged DNA and their interaction with DNA-binding proteins using a combination of atomic force microscopy (AFM) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS). In the beginning of this scientific work we therefore focus our efforts on the development of a reproducible protocol for the surface-deposition of different biomolecules, such as linear and circular DNA, different types of proteins and DNA-protein complexes. The analysis of the apparent contour length of intact DNA molecules of different lengths and under different preparation routines is found to be consistent with its B-DNA conformation. In this thesis we report about the first structural study of long DNA molecules that carry UV-light photolesions at random sites. An exposure of DNA to UV light introduces different modifications to the DNA structure: regions of unpaired DNA of different lengths, sharp kinks, the presence of knot like structures and single-strand breaks. In addition, the dynamics of damage accumulation can be traced with AFM. UV-exposure influences both the apparent contour length and the persistence length of the molecules. The structure of UV light damaged DNA strongly depends on the exposure time. Longer UV-light exposure time introduces increasing DNA damage. An FCS study on DNA exposed to UV-light shows that the presence of photoadducts influences the hydrodynamic properties of DNA molecules. The results obtained using both AFM and FCS are compared with gel-electrophoretical experiments. Further, we report about a first AFM study of the hRPA binding properties to intact and damaged DNA. The damage types under investigation were a 6 nt bubble modification, a cisplatin modification as well as lesions induced by UV-light. In our AFM experiment we never find RPA to be bound to the intact dsDNA chain. In complexes with intact DNA human RPA is only found to be bound to the termini of the linear DNA molecules. Human RPA binds with a very low affinity to both DNA containing a 6 nt bubble modification and a single cisplatin modification. Moreover, hRPA showed in this case still a preferential binding to the ends of the linear DNA molecules as seen in the complexes with intact DNA. Because of the low binding strength of hRPA to the cisplatin intrastrand adduct it is easily possible to remove the protein from its DNA complexes by scanning movements of the AFM tip. The images of the DNA molecules after removal of the hRPA proteins show significant distortions of the DNA chain, namely: the separation of the double strand into single-strands resulting in a large region of unpaired bases. Such structures are never observed in images of DNA carrying a cisplatin lesion before the addition of hRPA. This fact may explain a possible role of hRPA in damage excision. Our experiments show a rather high affinity of hRPA to UV-light damaged DNA that increases with UV-light exposition time. The formation of complexes of hRPA and UV-light damaged DNA molecules was studied by both EMSA and AFM. When hRPA was added to the damaged DNA, globular objects sitting on the rod shaped DNA strands were regularly observed in the AFM images. A systematic analysis of the apparent contour length of DNA molecules in protein-DNA complexes reveals a reduction of the contour length in comparison to the one of uncomplexed DNA molecules damaged for the same time. Such reduction of 27.7±7.6 nm suggests a wrapping of the DNA molecule around the hRPA protein. Additionally, using the hRPA-DNA system, we show that the application of the phase signal allows to differentiate between components of similar architecture, but different origin within one AFM image. The last chapter of the thesis is dedicated to the analysis of the DNA-binding properties of ORF80, a novel leuzine protein of unknown physiological role. Our AFM measurements demonstrate that under low protein concentration a specific binding of ORF80 dominates. To the best of our knowledge ORF80 is the smallest protein that was resolved in complexes with DNA by AFM. The single molecule approach in the study of the ORF80 binding properties to DNA with AFM shows that one, at most two ORF80 monomers recognize a specific sequence on the dsDNA. Both AFM and FCS clearly show that higher ORF80 concentrations lead to the formation of big protein-DNA agglomerates that contain numerous DNA and protein molecules. The formation of these agglomerates can be explained both by the unspecific ORF80 binding and its high aggregation properties.show moreshow less
In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir intakte und geschädigte Desoxyribonukleinsäure (DNA) und ihre Wechselwirkung mit DNA-bindenden Proteinen mittels einer Kombination von Raster-Kraft-Mikroskopie (AFM) und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS). Am Anfang dieser Forschungsarbeit haben wir uns daher mit dem Entwicklung eines reproduzierbaren Protokolls zur Immobilisierung verschiedener Molekültypen auseinandergesetzt, wie z.B. linearer and zirkularer DNA, unterschiedlicher Proteine sIn der vorliegenden Arbeit untersuchen wir intakte und geschädigte Desoxyribonukleinsäure (DNA) und ihre Wechselwirkung mit DNA-bindenden Proteinen mittels einer Kombination von Raster-Kraft-Mikroskopie (AFM) und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS). Am Anfang dieser Forschungsarbeit haben wir uns daher mit dem Entwicklung eines reproduzierbaren Protokolls zur Immobilisierung verschiedener Molekültypen auseinandergesetzt, wie z.B. linearer and zirkularer DNA, unterschiedlicher Proteine sowie DNA-Protein Komplexen. Die Analyse der Konturlänge intakter DNA Moleküle mit unterschiedlichen Längen und mit unterschiedlichen Methoden präpariert zeigt, dass sich die DNA auf der Oberfläche in der B-DNA Konformation befindet. In dieser Arbeit berichten wir über die erste strukturelle Untersuchung von DNA Molekülen mit unspezifischen UV-Schäden. Die Bestrahlung der DNA mit UV-Licht erzeugt unterschiedliche Modifikationen in der Struktur der DNA: Regionen ungepaarter DNA von unterschiedlicher Länge, scharfe Knicke, die Anwesenheit von Knotenstrukturen und Brüche von Einzelsträngen. Zusätzlich kann die Dynamik der Schadensakkumulation in der DNA mittels AFM nachgewiesen werden. Die Bestrahlung mit UV-Licht beeinflusst sowohl die Konturlänge als auch die Persistenzlänge der Moleküle. Die strukturellen Veränderungen UV-bestrahlter DNA sind von der Belichtungszeit abhängig. Längere Belichtungszeiten führen zu einer Zunahme der DNA Schäden. FCS Experimente an UV-bestrahlter DNA zeigen den Einfluss der Schädigungen auf die hydrodynamischen Eigenschaften der DNA Moleküle. Die Ergebnisse der AFM und FCS Messungen werden mit Gelelektrophoresedaten verglichen. Weiter berichten wir über die erste AFM Untersuchung der Bindungseigenschaften des Proteins hRPA zu intakter und geschädigter DNA. Die untersuchten Schädigungen der DNA sind im Detail eine definierte 6 nt Mismatch Modifikation, eine Cisplatin-Modifikation, sowie von UV-Licht verursachter Schaden. In unseren AFM Experimenten haben wir niemals die Bindung von hRPA zu der intakten DNA-Kette festgestellt. Das humane RPA Protein wurde nur als Komplex an den Molekülenden der intakten, linearen DNA Moleküle gefunden. Dieses hRPA bindet mit einer sehr niedrigen Affinität sowohl zu einer 6nt Mismatch Modifikation als auch zu einer definierten Cisplatin-Modifikation. Zusätzlich zeigt hRPA in diesem Fall eine präferenzielle Bindung zu den Enden der linearen DNA Moleküle, wie in den Experimenten mit ungeschädigter DNA. Auf Grund der niedrigen Bindungsstärke von hRPA zum Cisplatin-Intrastrang-Addukt war es sehr einfach möglich das Protein von seinem Komplex mit der DNA mittels der Rasterbewegungen der AFM-Spitze zu trennen. Die Abbildungen der DNA Moleküle nach der Entfernung der Protein Moleküle zeigen eine bedeutende Veränderung in der DNA-Kette. Der Doppelstrang wird in Einzelstränge getrennt, und lange Regionen von ungepaarten Basen entstehen. Solche strukturellen Änderungen treten niemals bei DNA Molekülen mit Cisplatin-Schaden vor der hRPA Zugabe auf. Diesen Fakt kann man womöglich mit der Rolle von hRPA in der Schadenexzision erklären. Unsere Experimente zeigen eine erhöhte Affinität von hRPA zu UV-Licht geschädigter DNA, die mit der UV-Dosis zunimmt. Die Bildung von Komplexen von hRPA und UV-licht geschädigter DNA wurde mittels Bandenretardationsexperimenten und AFM untersucht. Sobald hRPA zu der DNA zugegeben wird, wurden regelmäßig in den AFM Abbildungen globulare Objekte auf den stäbchenförmig erscheinenden DNA Molekülen gefunden. Eine systematische Analyse der Konturlänge der DNA Moleküle in Protein-DNA-Komplexen zeigt eine Verkürzung der Konturlänge im Vergleich zu DNA die unter den gleichen Bedienungen geschädigt wurde. Die Verkürzung von 27.7±7.6 nm weist auf eine Wicklung der DNA um das hRPA Protein hin. Zusätzlich zeigen wir am Beispiel des Modelsystems aus hRPA und UV-Licht-geschädigter DNA, dass das AFM-Phasensignal eine Unterscheidung zwischen Strukturen ähnlicher Architektur, aber unterschiedlicher Herkunft in einer AFM Abbildung ermöglicht. Das letzte Kapitel dieser Arbeit behandelt die Analyse der DNA-bindenden Eigenschaften von ORF80, ein Protein mit unbekannter physiologischer Funktion. Unsere AFM Untersuchungen zeigen, dass bei niedrigen Konzentrationen eine spezifische Bindung von ORF80 überwiegt. Zu unserer Kenntnis ist ORF80 das kleinste Protein, das mittels AFM in Komplexen mit DNA bisher untersucht wurde. Der Einsatz unserer einzelmolekularen Methoden zeigt, dass maximal zwei ORF80 Moleküle ortspezifisch zur dsDNA binden. Die Kombination von AFM und FCS zeigt deutlicht, dass sich unter höheren ORF80 Konzentrationen größere Protein-DNA Agglomerate ausbilden, die aus mehreren DNA und Protein Molekülen bestehen. Die Bildung solcher Agglomerate bei hohen Protein Konzentrationen kann man sowohl mit der unspezifischen ORF80 Bindung als auch durch seine hohe Agglomerationstendenz erklären.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Marina Lysetska
Advisor:Prof. Dr. Georg Krausch
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:19.07.2004
Year of Completion:2004
SWD-Keyword:DNS-Reparatur; DNS-Schädigung; Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie; Rasterkraftmikroskop
Tag:Einzelmolekül
DNA damage; DNA repair; atomic force microscopy; fluorescence correlation spectroscopy; single molecule
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-1672
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):04.08.2005