Angiogenic Potential of Mesenchymal Cells and T Lymphocytes Induced by Mechanical Stimuli that Improve Bone Healing – An In Vitro 2D and 3D Bioreactor Study

Angiogenes Potential mesenchymaler Zellen und T-Lymphozyten induziert durch knochenheilungsfördernde mechanische Stimuli – Eine in vitro 2D und 3D Bioreaktorstudie

  • Eine Ursache für die verzögerte oder ausbleibende Heilung von Knochenbrüchen kann die fehlende Revaskularisierung sein. Auch ist bekannt, dass mechanische Stimulation die Knochenheilung durch die Verbesserung der Revaskularisierung und Knochenbildung fördern kann, allerdings darf sie dabei ein gewisses Maß nicht über- bzw. unterschreiten, da sonst die Heilung beeinträchtigt würde. Verschiedene Zelltypen und molekulare Prozesse sind im Verlauf der Knochenheilung involviert. Mesenchymale StammzellEine Ursache für die verzögerte oder ausbleibende Heilung von Knochenbrüchen kann die fehlende Revaskularisierung sein. Auch ist bekannt, dass mechanische Stimulation die Knochenheilung durch die Verbesserung der Revaskularisierung und Knochenbildung fördern kann, allerdings darf sie dabei ein gewisses Maß nicht über- bzw. unterschreiten, da sonst die Heilung beeinträchtigt würde. Verschiedene Zelltypen und molekulare Prozesse sind im Verlauf der Knochenheilung involviert. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) und ihre differenzierten Nachfolgezellen sind dafür bekannt, eine Rolle in der Angiogenese und Geweberegeneration einzunehmen, die durch mechanische Stimulation verstärkt werden kann. Sie sind wenige Tage nach der Fraktur im entstandenen Hämatom und im Frakturspalt nachweisbar. Auch Lymphozyten sind in dieser frühen Phase im Frakturspalt zu finden und ihre Entfernung scheint die Heilung zu beschleunigen. Aber genaue Kenntnisse über die mechanisch induzierte Antwort von Zellen, insbesondere von T-Lymphozyten, auf molekularer Ebene während der Knochenheilung fehlen bisher. Die gegenwärtige in vitro Studie hat das Ziel, den Einfluss mechanischer Stimuli, wie sie während der frühen Knochenheilung auftreten, zu untersuchen und relevante, die Knochenheilung fördernde molekulare Prozesse zu identifizieren. Um die mechanisch induzierte Antwort zu untersuchen, wurde eine umfassende Charakterisierung der Dehnungs- und Flüssigkeitsscherung in der 2D Zellkultur mittels „digital image correlation“ und „computational fluid dynamics“ durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Dehnungsumgebung nur in einem kleinen Zeitfenster reproduzierbar ist und nur etwa die Hälfte der applizierten Dehnung auch auf einzelne Zellen übertragen wird. Dehnung und Flüssigkeitsscherung agieren beide in einer Größenordnung, die für mechanische Stimulation von mesenchymalen Zellen relevant sind. Eine Kurzzeitstimulation mesenchymaler Zellen, unter den ermittelten Rahmenbedingungen, führte zur Clusterbildung von αVβ3 Integrin, welches auch an der Angiogenese beteiligt ist. Um die Interaktion zwischen MSCs und T-Lymphozyten zu untersuchen, wurde eine an das Frakturhämatom angepasste 3D Umgebung gewählt Damit wurde die Auswirkung von zyklischen Kompressionen, die bekanntermaßen vorteilhaft für die Knochenheilung sein sollen, getestet. MSCs und ihre Ko-Kultur mit T-Lymphozyten zeigten nach der Stimulation ein erhöhtes angiogenes Potential, welches mittels Proteinexpression und einem Gefäßbildungsassay ermittelt wurde. T-Lymphozyten allein zeigten dies nicht, nur ein differentiell verändertes mRNA Expressionsprofil nach mechanischer Stimulation. Insgesamt war das angiogene Potential der Ko-Kulturen niedriger als das der MSCs, vermutlich durch eine Immunantwort auf die allogenen Kulturbedingungen. Auf mRNA-Ebene zeigte sich nach mechanischer Stimulation eine verminderte Expression immunrelevanter Gene. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die heilungsfördernde mechanische Stimulation die Angiogenese, vermittelt durch mesenchymal Zellen, verbessert. Außerdem scheint mechanische Belastung die vorhandene Immunantwort im Frakturhämatom zu verringern. Letzteres ist neu und daher von großem Interesse für die klinische Forschung, da ein weiterer Ansatz gefunden wurde, wie mechanische Stimulation zur Verbesserung des Heilungsergebnisses beiträgt.show moreshow less
  • Delayed healing and non-unions of bone fractures can result among others from impaired revascularisation. Mechanical stimulation is able to improve bone healing by enhancing revascularisation and bone formation but if exceeding a limit or being too low the opposite can occur. Different cell types and molecular processes are involved in the course of bone healing. Mesenchymal stem cells (MSCs) and their differentiated successors are known to play a role in angiogenesis and tissue regeneration enhDelayed healing and non-unions of bone fractures can result among others from impaired revascularisation. Mechanical stimulation is able to improve bone healing by enhancing revascularisation and bone formation but if exceeding a limit or being too low the opposite can occur. Different cell types and molecular processes are involved in the course of bone healing. Mesenchymal stem cells (MSCs) and their differentiated successors are known to play a role in angiogenesis and tissue regeneration enhanced by mechanical stimulation. They are detectable a few days after fracture in the haematoma that has formed in the fracture gap. Lymphocytes are mainly present in the very beginning after fracture and their depletion seems to accelerate healing. However, detailed knowledge of the mechano-response of cells, especially T lymphocytes, during fracture healing on the molecular level is missing. The present in vitro study aimed to examine effects of mechanical stimuli, as occurring during the onset of bone healing, to identify relevant molecular events improving bone healing. To study mechano-responses of mesenchymal cells a thorough mechanical characterisation of the strain and fluid shear stress environment of a 2D cell stimulation device was performed using digital image correlation and computational fluid dynamics. The strain environment was found to be consistent only within a short time frame and about half of the strain applied was transferred to cells. The strains and fluid shear stresses acting in concert were found to be in a range relevant for mesenchymal cell responses. A short-term stimulation of mesenchymal cells under now well defined boundary conditions resulted in the clustering of the angiogenesis related protein αVβ3 integrin. To study the interaction of MSCs and T lymphocytes, a fracture haematoma-like 3D environment was chosen to test the effect of a cyclic compression known to be favourable for bone healing. MSCs and their co-cultures with T lymphocytes showed after stimulation an increased angiogenic potential, concluded from their protein expression and a tube formation assay. T lymphocytes alone showed no angiogenic potential but were mechano-responsive on mRNA level. However, the angiogenic potential in co-cultures was lower than that of MSCs, possibly due to an ongoing immune response, as an allogenic setting was used. On mRNA level, the immune response was reduced after mechanical stimulation. In conclusion, mechanical stimulation in sizes relevant for an improvement of bone healing, stimulates angiogenesis promoted by mesenchymal cells and seems to reduce present immune reactions in the haematoma. Especially the latter is a new finding of great interest for the clinic as it further elucidates how mechanical stimulation improves the healing outcome.show moreshow less

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Metadaten
Author: Friederike Hanna Bieler
URN:urn:nbn:de:kobv:83-opus-29642
Advisor:Prof. Dr. rer. nat Roland Lauster
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2011/03/01
Publishing Institution:Technische Universität Berlin
Granting Institution:Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Date of final exam:2010/12/14
Release Date:2011/03/01
Tag:Immunreaktion; Knochenheilung; T-Lymphozyt; mechanische Stimulation; mesenchymale Zelle
T lymphocyte; bone healing; immune reaction; mechanical Stimulation; mesenchymal cell
Institutes:Externe Einrichtungen
Dewey Decimal Classification:620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
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