Herstellung und Untersuchung eines kollagenen Knorpelersatzmaterials aus porcinen Menisken

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2015-01-27
Issue Year
2014
Authors
Körber, Ludwig
Editor
Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, porcines Meniskusgewebe durch einen nasschemischen Prozess zu reinigen. Unter Erhalt des natürlichen 3D Kollagennetzwerkes sollten nicht kollagene Gewebebestandteile so weit entfernt werden, dass das resultierende Matrixmaterial biokompatibel ist und daher ohne inflammatorische Reaktionen hervorzurufen als Transplantatmaterial in der Humanchirurgie Anwendung finden kann. Das Material sollte außerdem seine Chondrokonduktivität nicht verlieren, durch xenogene (bovin) Meniskusfibrochondrozyten revitalisierbar sein, Zellmigration sowie eine Neubildung meniskusspezifischer extrazellulärer Matrixkomponenten durch die bovinen Meniskusfibrochondrozyten begünstigen. Die Untersuchungen der Kollagenmatrix zeigen, dass mit dem siebenstufigen Reinigungsprozess (siehe Kapitel 4.3) unter Erhalt der natürlichen 3D Kollagenstruktur zelluläre Bestandteile, nicht kollagene Komponenten (Glykosaminoglykane GAG) und Keime so weit reduziert werden, wie es für ein Transplantatmaterial notwendig ist. Entscheidend verantwortlich sind dafür zwei alkalische Behandlungen mit 1 N NaOH sowie je eine Behandlung in 1 M Guanidiniumchlorid und 5 % Wasserstoffperoxid. Histologisch sind keine Zellen nachweisbar und die biochemischen Analysen zeigen, dass der DNA Gehalt bis unter die Nachweisgrenze von 0,06 ng/mg reduziert werden konnte. Die für die antigenen Eigenschaften tierischen Gewebes verantwortlichen entzündungsrelevanten Determinanten (α Gal-Epitope) konnten um einen Faktor größer als 2,56∙102 abgereichert werden. Aussagen hinsichtlich möglicher immunologischer Reaktionen lassen sich anhand dieser Ergebnisse nicht treffen. Letztendlich kann die Qualität der Kollagenmatrizes nur im Tierversuch verlässlich analysiert werden. Daher besteht hinsichtlich der α Gal Entfernung weiterer Optimierungsbedarf. Der GAG Gehalt nimmt signifikant um 61,37 % ab, wodurch zelluläre Komponenten leichter entfernt, das Gewebes aufgelockert und potentielle Migrationswege für Zellen freigelegt werden können. GAG Restgehalt werden auch positiv bewertet, da offensichtlich GAG und Proteoglykane die Biokompatibilität begünstigten. Der Anteil an denaturiertem Kollagen (wD) ändert sich durch das Herstellungsverfahren gegenüber dem in nativem Gewebe nicht signifikant. Sowohl rasterelektronenmikroskopische, als auch transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen belegen den Erhalt der 3D Kollagenstruktur und damit der Matrixintegrität. Für eine erste biologische Beurteilung der Kollagenmatrix wurde ein in vitro Zytotoxizitätstestsystem nach ISO-Standards (EN ISO 10993 5:2009 ) durchgeführt, welches durch Serumentzug zusätzlich sensibilisiert wurde. In diesem Testsystem sind gemäß ISO Standards selbst nach Sensibilisierung keine zytotoxischen Effekte der Kollagenmatrix auf verschiedene Indikatorzellen (murine Fibroblastenzelllinie L929, selbst isolierte primäre bMFC und primäre hBMSC), festgestellt worden. Für Besiedelungsversuche mit xenogenen Zellen wurden primäre bovine Meniskusfibrochondrozyten isoliert unter optimalen Kulturbedingungen für die erforderliche Zellzahl amplifiziert. Eine standardisierte Vorgehensweise nach der Zellisolierung bei der Amplifikation sollte bekannte, durch Expansion in 2D Kultur bedingte Dedifferenzierungen der bMFC vermeiden oder so weit als möglich zu verringern und zudem die Reproduzierbarkeit und auch die Vergleichbarkeit von Ergebnissen untereinander gewährleisten. Alle Besiedelungsversuche belegen eine sehr gute Akzeptanz und mit bis zu 112 d Kultivierungsdauer die langfristige Revitalisierbarkeit der prozessierten Kollagenmatrix. Bei den verwendeten Medien konnten deutliche Unterschiede festgestellt werden. Es zeigten sich signifikante Unterschiede hinsichtlich des Zellwachstums und der Matrixsynthese der bMFC. Kultivierungen in DMEM/Hams F12 mit den migrationsfördernden Wachstumsfaktoren HGF und PDGF AB konnten die in der Literatur geschilderte, gesteigerte Proliferation und auch die Förderung der Migration aufgrund abnehmender Zellzahl sowie nicht beobachteter Matrixsynthese nicht bestätigen. Offensichtlich fehlen den Zellen in diesem Medium essentielle Mediumzusätze, die Zellwachstum und vor allem EZM Neusynthese unterstützen. Für weitere Versuche müssten weitere Mediumzusätze eingesetzt werden, um das Zellwachstum und die Matrixsynthese zu fördern. Wird DMEM/Hams F12 Medium 10 % FBS zugesetzt, wurde auch nach 42 d keine signifikante de novo EZM Synthese beobachtet. Es bildete sich eine bis zu 50 µm dicke Schicht aus Zellen und neuem Gewebe. Histologisch war nur geringe GAG Bildung und immunohistologisch nur geringe Bildung von Kollagen Typ I und Aggrecan nachweisbar. Kollagen Typ II war nicht nachweisbar. Nach 14 d konnte Migration einzelner Zellen entlang der Kollagenfasern bis zu 400 µm in die Kollagenmatrix hinein histologisch belegt werden. Die Besiedelungsexperimente mit NHChondroDiff Medium zeigen im Vergleich zu DMEM/Hams F12 mit 10 % FBS und DMEM/Hams F12 mit den migrationsfördernden Wachstumsfaktoren HGF und PDGF AB, dass vor allem das zur Kultivierung verwendete Medium eine entscheidende Rolle spielt. Bei Kultivierung in NHChondroDiff Medium konnten reproduzierbar bereits nach 14 d ausgeprägte Matrixsynthese sowie Zellmigration beobachtet werden. Während der ersten 70 d nimmt die Dicke neugebildeten Gewebes auf der Kollagenmatrix kontinuierlich bis ca. 300 400 µm zu und bleibt dann innerhalb des Beobachtungszeitraums von 112 d konstant. Zudem sind Zellen über 400 μm weit in das Gewebe migriert wobei die Migration entlang der Kollagenfasern beobachtet wird. Auch migrierte bMFC bilden im Inneren des Scaffolds neue EZM. Die Migration, hängt von der Ausrichtung und Dichte der Kollagenfasern ab. Die Neubildung extrazellulärer Matrix und Zellmigration belegen wiederum die chondrokonduktiven Eigenschaften der Kollagenmatrix. Immunohistologisch konnte die de novo Synthese aller für Meniskusknorpel typischen EZM–Bestandteile, wie Aggrecan, Kollagen Typ I und Kollagen Typ II nachgewiesen werden. Bei der Quantifizierung des Hydroxyprolingehalts als Maß für die Kollagenbildung und des Chondroitinsulfatgehalts als Maß für die Bildung der Glykosaminoglykane ergab sich ein gleichbleibender Anteil bezogen auf die neugebildete Gewebemasse und mit deren Anwachsen dementsprechend eine kontinuierliche Steigerung. Die ausgeprägte Neusynthese von EZM scheint allerdings die Zellmigration zunehmend zu inhibieren, so dass die Zellen in der Matrix dann fixiert und immobilisiert vorliegen. Die oberflächliche Gewebeschicht mit neu synthetisierter EZM behindert offensichtlich die Versorgung der einwandernden Zellen nicht, das diese weiterhin EZM synthetisieren. Insgesamt liefert die Kultivierung in NHChondroDiff sehr gute Ergebnisse hinsichtlich de novo Matrixsynthese sowie eine deutlich stimulierte Zellmigration und Proliferation zu Beginn der Kultivierung. Vermutete Nährstofflimitierungen bei steigender Kulturdauer (>56 d) könnten durch entsprechende Anpassung des Medienvolumens mit steigender Kulturdauer oder auch kürzere Wechselintervalle in weiteren Arbeiten vermieden oder deutlich vermindert werden. Kultivierungen in definierten Medien mit migrationsfördernden Wachstumsfaktoren und den Metabolismus steigernden Zusätzen ergab wie beabsichtigt eine verlangsamte EZM Neubildung und einen verbesserte Zellmigration aufgrund verminderter Immobilisierung. Die de novo-Matrixsynthese auf den besiedelten Scaffolds ist in allen Versuchen in vergleichbarer Weise beobachtbar und auch nach bis zu 52 d deutlich geringer als in NHChondroDiff Medium. Immunohistologische Färbungen zeigen deutlich die Bildung von Kollagen Typ I. Im Vergleich dazu konnte nur eine geringe Synthese von Kollagen Typ II und von Aggrecan beobachtet werden. In allen DMEM Medienvariationen ist die Zellmigration im Vergleich zu DMEM/Ham`s F12 mit 10% FBS bereits nach 14 d gesteigert und mit der in NHChondroDiff vergleichbar. Signifikante Unterschiede hinsichtlich der Zellmigration wurden bei Scaffolds mit superfizieller Schicht festgestellt. Bei Proben mit superfizieller Schicht konnten keine Zellen durch die superfizielle Schicht in das Innere des Gewebes migrieren. Diese wird vermutlich durch das dichte Netzwerk zufällig angeordneter Kollagenfasern behindert, das diesen Gewebebereich auszeichnet. Dagegen konnten bei Scaffolds ohne superfizielle Schicht stets Zellmigration in unterschiedlichem Ausmaß entlang von Kollagenfasern beobachtet werden. Die Kollagenmatrix bietet für einen langfristig erfolgreichen Ersatz von Meniskusgewebe essentielle Eigenschaften, indem Zellen und Zellbestandteile und nicht kollagene Gewebebestandteile unter Erhalt der natürlichen 3D Gewebestruktur aus dem Meniskusgewebe entfernt wurden. Wie alle Untersuchungen zeigen, besitzt die Kollagenmatrix in vitro sehr gute chondrokonduktive Eigenschaften und eine ausgezeichnete biologische Verträglichkeit. Daher bietet sich die Kollagenmatrix als vielversprechende Alternative zu bisherigen Ersatzmaterialeien an.

DOI
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