Nachweis der Surfactant Proteine A, B, C und D im Epithel der humanen Gingiva sowie deren Quantifizierung in gesundem und pathologisch verändertem Speichel

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2014-10-14
Issue Year
2014
Authors
Stengl, Christina
Editor
Abstract

1.1 Objective The purpose of this study is to evaluate whether the Surfactant Proteins SP-A, SP-B, SP-C and SP-D can be detected in human gingiva and saliva. Furthermore it should be checked if there was a significant difference in quantity of Surfactant Proteins in saliva from healthy patients and patients with pathologically altered gingiva. 1.2 Methods The tissues used in the investigations were taken from 19 healthy patients and patients who were suffering from periodontal disease. These were taken 80 saliva samples from volunteers, half from healthy patients half from patients suffering from periodontal disease. The expression of mRNA for SP-A, -B, -C and -D was analyzed by RT-PCR in healthy gingiva with three samples from different patients. The distribution of all Surfactant Proteins was determined with monoclonal antibodies in three samples from healthy patients by means of Western Blot analysis for each Surfactant Protein. The Western Blot analysis were also used for investigations on saliva from healthy patients and patients suffering from periodontal disease. For immunohistochemistry, tissue specimens from healthy and pathologic (gingivitis) tissues were sectioned (6 µm) and the Surfactant Proteins were visualized with monoclonal antibodies and tissue colours. To make statements to the concentration for each Surfactant Protein in the saliva there is a cohort study from 40 healthy and 40 pathologic samples which are analyzed with the technique of ELISA. 1.3 Results The results of our studies indicate obviously that all expected Surfactant Proteins exist in the gingival epithelium and saliva of humans. On mRNA level the evidence was made in comparison to ß-actin. For Western Blot analyses samples from healthy human lung tissue were used as positive controls due to Surfactant Protein being present. In the case of immunohistochemical analyses samples of healthy human lung tissue was used for positive control as well. It is clearly recognizable that the expression of the proteins in healthy and pathologic tissue is different. While the immunoreaction is homogeny in the healthy tissue as expected the reaction of the antibodies in pathologic tissues is much more intensive. 1.4 Conclusion Our results indicate that the Surfactant Proteins SP-A, SP-B, SP-C and SP-D are peptides of healthy gingiva and reveal alteration regarding the expression pattern within pathological states of gingiva. Based on the known direct and indirect antimicrobial effect, the Surfactant Proteins A and D appear to be involved in immune defense inside the oral cavity especially in direct proximity of teeth. Tissue affected by bacterial inflammation (gingivitis) seems to induce overexpression of the Surfactant Proteins. This could increase the rheology of saliva especially at the crest of the gingival epithelium to support the function of antimicrobial peptides present in saliva.

Abstract

1.1 Hintergrund und Ziele Im Rahmen der vorliegenden Studie sollte die Existenz der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D in der menschlichen Gingiva nachgewiesen und im Speichel bestätigt werden. Des Weiteren sollte überprüft werden, ob ein signifikanter Unterschied an der Menge der Surfactant Proteine im Speichel gesunder und an Zahnfleischentzündungen erkrankter Patienten besteht, da Surfactant Proteine, wie bereits in zahlreichen Studien bewiesen, modulierend in Entzündungsprozesse eingreifen. 1.2 Methoden In den Untersuchungen wurden Gewebeproben verwendet, die den Biopsien 19 gesunder und an Parodontalerkrankungen leidender Patienten im Alter von 21 bis 69 Jahren entstammten. Es wurden zusätzlich 80 Speichelproben entnommen, 40 davon von gesunden Probanden, 40 davon von Patienten, die an einer Zahnfleischentzündung erkrankt waren. Der Nachweis der Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D auf mRNA Ebene wurde mit Hilfe der RT-PCR in gesunder Gingiva von jeweils drei unterschiedlichen Patienten erbracht. Mittels Western Blot konnten die Surfactant Proteine in drei Gewebeproben gesunder Patienten für jedes Surfactant Protein mit Hilfe monoklonaler Antikörper detektiert werden. Es wurden auch Western Blot Analysen am Speichel gesunder und an einer parodontalen Erkrankung leidenden Patienten durchgeführt. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden Gewebedünnschnitte (6 µm) von gesunden und pathologischen Gewebeproben hergestellt und die Surfactant Proteine mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern und Gewebefärbungen visualisiert. Um quantitative Aussagen bezüglich der Konzentration der einzelnen Surfactant Proteine im Speichel treffen zu können, wurde eine Kohorten-Studie von jeweils 40 gesunden und 40 erkrankten Patienten durchgeführt und mittels ELISA ausgewertet. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Die Ergebnisse der durchgeführten Versuche zeigten eindeutig, dass die vier Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D im gingivalen Epithel und dem Speichel des Menschen vorkommen. Auf mRNA Ebene wurde der Beweis im Vergleich zu Plasmid DNA erbracht, welche den ORF der entsprechenden Surfactant Proteine enthält. Bei den Western Blot Analysen wurde als Positivkontrolle das Gewebe gesunder menschlicher Lunge genutzt, in dem das Vorkommen der Surfactant Proteine allgemein bekannt ist. Auch bei den immunhistochemischen Analysen wurde das Gewebe humaner Lunge als Positivkontrolle mitgeführt. Es wurde deutlich, dass sich das Expressionsverhalten der Proteine in gesunden und pathologischen Gewebeschnitten unterscheidet. Während die Antigen-Antikörperreaktion in gesunden Epithelien wie erwartet sehr homogen ausfiel, waren in den pathologischen Proben deutlich stärkere Antikörperreaktionen zu erkennen.

1.4 Praktische Schlussfolgerungen Aus den ermittelten Ergebnissen geht hervor, dass die Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D reguläre Bestandteile der gesunden Gingiva sind, aber eine Veränderung ihres Expressionsverhaltens zeigen, sobald pathologisch verändertes Gewebe untersucht wird. Wie bereits bekannt ist, besitzen die Surfactant Proteine A und D direkte und indirekte antimikrobielle Eigenschaften. So scheinen sie einen direkten Einfluss auf das Immunsystem der Mundhöhle zu besitzen. Gewebe, welches durch die Anwesenheit und den Einfluss der Abbauprodukte verschiedenster Bakterien entzündlich verändert ist, zeigt eine Überexpression an den Surfactant Proteinen SP-A, SP-C und SP-D. SP-B hingegen wird in geringerer Menge exprimiert. Durch die veränderte Surfactant-Konzentration des Speichels könnten die Immunantwort und die Fließfähigkeit des Speichels gerade am Übergang zum gingivalen Saumepithel verbessert werden und die antimikrobiellen Peptide im Speichel an Effizienz gewinnen.

DOI
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