Analysen zur subzellulären Verteilung von Zucker- und Zuckeralkoholtransportern in Arabidopsis thaliana

Analyses of the subcellular distribution of sugar and sugar alcohol transporters in Arabidopsis thaliana

  • Im Fokus dieser Arbeit stand die Analyse subzellulärer Sortierungsprozesse von Membranproteinen in Mesophyllzellen von A. thaliana. Dazu sollten anhand des tonoplastidären Inosittransporters AtINT1 und des plasmamembranständigen Inosit-transporters AtINT4 spezifische Sortierungssignale innerhalb der Proteinsequenzen und lösliche Adaptorproteine identifiziert werden, die eine gezielte Verteilung der Transporter vermitteln. Um die Suche nach potentiellen Sortierungssignalen einzugrenzen, wurden zunächst diejenigen Proteindomänen ermittelt, die für eine korrekte Verteilung von AtINT1 und AtINT4 essentiell sind. Hierfür wurden verschiedene zytosolische Bereiche (N-Terminus, Mittelloop, C-TerminuIm Fokus dieser Arbeit stand die Analyse subzellulärer Sortierungsprozesse von Membranproteinen in Mesophyllzellen von A. thaliana. Dazu sollten anhand des tonoplastidären Inosittransporters AtINT1 und des plasmamembranständigen Inosit-transporters AtINT4 spezifische Sortierungssignale innerhalb der Proteinsequenzen und lösliche Adaptorproteine identifiziert werden, die eine gezielte Verteilung der Transporter vermitteln. Um die Suche nach potentiellen Sortierungssignalen einzugrenzen, wurden zunächst diejenigen Proteindomänen ermittelt, die für eine korrekte Verteilung von AtINT1 und AtINT4 essentiell sind. Hierfür wurden verschiedene zytosolische Bereiche (N-Terminus, Mittelloop, C-Terminus) der Transporter gegeneinander ausgetauscht und anschließend die subzelluläre Lokalisation der resultierenden Chimären und der Wt-Proteine verglichen. Dabei zeigte sich, dass durch den Austausch der C-Termini von AtINT1 und AtINT4 auch ein Wechsel der Zielmembranen bei den Chimärenproteinen herbeigeführt wurde. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit konnte anhand von Sequenzvergleichen mit AtINT1-ähnlichen putativen H+/Inosittransportern aus anderen Pflanzen ein konserviertes Dileucinmotiv des [D/E]XXXL[L/I]-Typs im C-Terminus von AtINT1 identifiziert werden. Gezielte Mutationen des Motivs bewirkten eine Umsortierung des Transporters in die Plasmamembran, wodurch gezeigt wurde, dass dieses Dileucinmotiv ein funktionelles Sortierungssignal darstellt und für die Lokalisation von AtINT1 in der Vakuolenmembran essentiell und ausreichend ist. Außerdem konnte der C-Terminus von AtINT1 als Werkzeug genutzt werden, um andere Transporter, wie z.B. AtPMT4, AtPMT6, AtSUC2 und AtSWEET1 aus unterschiedlichen Membranen des sekretorischen Systems in die Vakuolenmembran umzusteuern. Hierbei hing die Funktionalität des Sortierungssignals von dessen Abstand zur Transmembran-spanne ab. So wurde gezeigt, dass ein effizientes Umsortieren der chimären Transporter nicht erfolgte, wenn der C-Terminus von AtINT1 an den intakten Transporter angehängt wurde, sondern nur dann, wenn dieser den proteineigenen C-Terminus ersetzte. Allerdings blieb die Aktivität der Transporter trotz ausgetauschter C-Termini erhalten, was anhand von Wachstumsanalysen im heterologen Hefesystem exemplarisch für SUC2Δ14/C1 nachgewiesen wurde. Anders als bei AtINT1 wurde im C-Terminus von AtINT4 überraschenderweise kein Sortierungssignal identifiziert. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus vollständig deletiert werden kann, ohne die subzelluläre Lokalisation von AtINT4 zu beeinflussen. Aufgrund dieses Ergebnisses und der Beobachtung, dass AtINT1 ohne funktionelles Sortierungssignal in der Plasmamembran lokalisiert ist, wird postuliert, dass die Plasmamembran die Zielmembran des default-Wegs für membranständige Proteine darstellt. Weiterhin konnte zum ersten Mal direkt eine Funktion des AP-Komplexes 3 (AP-3) bei der subzellulären Verteilung von sekretorischen Proteinen innerhalb der Pflanzenzelle nachgewiesen werden. Anhand von Lokalisationsstudien in ap3 ß-Protoplasten wurde gezeigt, dass AtINT1 auf einem AP-3-unabhängigen Weg an die Vakuolenmembran transportiert wird, während aber ein funktioneller AP-3-Komplex für die korrekte Sortierung des tonoplästidären Saccharosetransporters AtSUC4 essentiell ist. Kolokalisationsstudien von GFP-SUC4 und unterschiedlichen Golgi-Markern zeigten, dass der Transport von AtSUC4 im ap-3 ß-Hintergrund im cis-Golgi blockiert wird, woraus sich schließen lässt, dass dort die Ausbildung AP-3-abhängiger Transportvesikel initiiert wird. Außerdem wurde gezeigt, dass sowohl für die korrekte Verteilung von AtINT1, als auch von AtSUC4 ein intaktes Golgi-Netzwerk erforderlich ist. Demnach existieren in Arabidopsis-Mesophyllzellen zwei unterschiedliche, Golgi-abhängige Transportwege an die Vakuole. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zusätzlich die Funktion des extrazellulären Loops von AtINT2, der die Transmembranspannen IX und X miteinander verbindet (IX/X-Loop), näher untersucht werden. Aus vorangegangenen Arbeiten war bereits bekannt, dass dieser IX/X-Loop mit Nickelionen interagieren kann und dass dadurch die Aktivität des Transporters verloren geht. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass acht konservierte Cysteinreste im IX/X-Loop von AtINT2 für die Interaktion mit Ni++ verantwortlich sind. Weiterhin wurde gezeigt, dass die vergleichbaren IX/X-Loops von anderen plasmamembranständigen H+/Inosittransportern, wie AtINT4 aus Arabidopsis und hHMIT aus dem Menschen, ebenfalls mit Ni++ interagieren und daraus ein Funktionsverlust der entsprechenden Transporter resultiert. Zusätzlich konnte erstmals eine funktionelle Charakterisierung des menschlichen Trans-porters hHMIT im heterologen Hefesystem durchgeführt werden. Hierbei wurde hHMIT als funktioneller H+/Inositsymporter mit einem KM-Wert von 0,33 ± 0,01 mM für myo-Inosit beschrieben.show moreshow less
  • The main subject of this work was the analysis of subcellular sorting processes for membrane proteins in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Therefore, the tonoplast-localized inositol transporter AtINT1 and the plasma membrane-localized inositol transporter AtINT4 were used to identify specific sorting signals within their protein sequences, as well as to determine soluble adapter proteins, which mediate the distinct targeting of these transporters. Protein domains responsible for the correct sorting of AtINT1 and AtINT4 were identified initially to limit the search for putative sorting signals on these areas. For that purpose different cytosolic domains of the transporters (N-terminusThe main subject of this work was the analysis of subcellular sorting processes for membrane proteins in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Therefore, the tonoplast-localized inositol transporter AtINT1 and the plasma membrane-localized inositol transporter AtINT4 were used to identify specific sorting signals within their protein sequences, as well as to determine soluble adapter proteins, which mediate the distinct targeting of these transporters. Protein domains responsible for the correct sorting of AtINT1 and AtINT4 were identified initially to limit the search for putative sorting signals on these areas. For that purpose different cytosolic domains of the transporters (N-terminus, middle loop, C-terminus) were swapped and the subcellular localization of the resulting chimera was compared to the localization of the respective wild type proteins. As a result it could be observed that the replacement of the C-termini from AtINT1 and AtINT4 led to a reverse localization of the chimeric proteins. Furthermore, comparing the sequences of AtINT1 and AtINT1-like putative H+/inositol transporters from other plants, a conserved [D/E]XXXL[L/I]-type dileucine motif was identified in the C-terminus of the transporter. Specific mutations affecting this motif induced the resorting of AtINT1 to the plasma membrane, demonstrating that the dileucine motif represents a functional sorting signal and is essential and sufficient for the targeting of AtINT1 to the tonoplast. Furthermore, the C-terminus of AtINT1 could be used as a tool to reroute other transporters, such as AtPMT4, AtPMT6, AtSUC2 und AtSWEET1, from distinct membranes within the secretory system to the tonoplast. The functionality of the sorting signal was dependent on its distance relative to the preceding transmembrane helix. Accordingly, efficient resorting of chimeric transporters was not achieved by addition of the AtINT1 C-terminus to the intact transporter, but only by replacement of the proteins own C-terminus. This replacement did not affect the activity of the transporter, as demonstrated via growth analyses after heterologous expression in yeast cells using AtSUC2Δ14/C1 as example. Surprisingly and in contrast to AtNT1, no sorting signal was identified within the C-terminus of AtINT4. In fact, even the deletion of the whole C-terminus did not affect the subcellular localization of AtINT4. On the basis of this result and the observation that AtINT1 is targeted to the plasma membrane when a functional dileucine motif is missing, it was postulated that the plasma membrane represents the target membrane of the default pathway for membrane-bound proteins. Additionally it was demonstrated for the very first time, that AP-3 is directly involved in the subcellular distribution of secretory proteins within the plant cell. Localization studies in ap-3 ß protoplasts revealed an AP-3 independent pathway for the transport of AtINT1 to the vacuolar membrane, while a functional AP-3 complex was essential for the correct sorting of AtSUC4, a tonoplast localized sucrose transporter. Colocalization assays of GFP-SUC4 and different Golgi markers demonstrated furthermore that the transport of AtSUC4 is blocked in cis-Golgi stacks in the ap-3 ß-background, leading to the assumption that AP-3 dependent transport vesicles are initiated at this particular location. Moreover for the correct sorting of both, AtSUC4 and AtINT1, an intact Golgi-network is required. Hence, two different Golgi-dependent trafficking pathways to the vacuole exist in Arabidopsis mesophyll cells. Additionally the functional characterization of the AtINT2 extracellular loop connecting the transmembrane helices IX and X should be continued during this work. As shown in previous analyses this IX/X-Loop interacts with Ni++ resulting in the loss of transport activity. In the present study it was now demonstrated that eight conserved cysteine residues within the IX/X-Loop of AtINT2 are responsible for the interaction with Ni++. Further investigations of comparable IX/X-loops, known to exist in other plasma membrane-localized H+/inositol transporters such as AtINT4 from Arabidopsis and human hHMIT, have shown similar interactions with Ni++ resulting in the corresponding loss of activity. In Addition, a functional characterization of the human transporter hHMIT was performed for the very first time in the heterologous yeast system, classifying hHMIT as functional H+/inositol symporter with a KM-value of 0.33 ± 0.01 mM for myo-inositol.show moreshow less

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Metadaten
Author:Susanne Wolfenstetter
URN:urn:nbn:de:bvb:29-opus-34903
Advisor:Norbert Sauer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/09/10
Publishing Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Granting Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2012/08/02
Release Date:2012/09/10
Tag:Adaptorprotein; Dileucinmotiv; HMIT; Inosittransporter; PSI-Domäne
HMIT; PSI-domain; adapter protein; dileucine motif; inositol transporter
SWD-Keyword:Chimäre DNS; Protein-Sortierung; Sekretion; Vakuole
Institutes:Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 12793 $