Entwicklung einer knockin Mauslinie mit Expression von humanem CD22 zum Test therapeutischer Anwendungen künstlicher CD22-Liganden

Generation of a human CD22 knockin mouse line for the analysis of therapeutic applications of synthetic CD22 ligands

  • In in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass das von uns entwickelte Immunotoxin BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA‘ CD22-positive humane B-Zelllinienzellen (Nalm6) spezifisch und effizient töten kann. In vivo konnten die Wirkung des Immunotoxins jedoch nicht bestätigt werden. In Xenotransplantationsexperimenten konnte kein verlängertes Überleben der NOD/SCID Mäuse, die mit Nalm6-Zellen behandelt waren, nach Gabe des Immunotoxins gezeigt werden. Wildtypmäuse, denen das Immunotoxin verabreicht wurde, bildeten spezifische Antikörper des Isotyps IgG gegen dieses. Der Anteil der B-Zellen war in diesen Mäusen jedoch 48 Stunden nach der BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA‘-Gabe reduziert. Ein Effekt des BPC-Neu5Ac-DimIn in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass das von uns entwickelte Immunotoxin BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA‘ CD22-positive humane B-Zelllinienzellen (Nalm6) spezifisch und effizient töten kann. In vivo konnten die Wirkung des Immunotoxins jedoch nicht bestätigt werden. In Xenotransplantationsexperimenten konnte kein verlängertes Überleben der NOD/SCID Mäuse, die mit Nalm6-Zellen behandelt waren, nach Gabe des Immunotoxins gezeigt werden. Wildtypmäuse, denen das Immunotoxin verabreicht wurde, bildeten spezifische Antikörper des Isotyps IgG gegen dieses. Der Anteil der B-Zellen war in diesen Mäusen jedoch 48 Stunden nach der BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA‘-Gabe reduziert. Ein Effekt des BPC-Neu5Ac-Dimers auf das Homing der B-Zellen konnte nicht gezeigt werden. Um Immunotoxine und Antikörper, die CD22 als Zielprotein nutzen, besser erforschen zu können, sollte eine CD22 knockin Maus generiert werden, die humanes CD22 statt murinem CD22 auf der B-Zelloberfläche exprimiert. Diese Huki CD22 Maus trägt, wie erwartet, nur humanes CD22 auf der Oberfläche. Dieses scheint jedoch weniger stark exprimiert zu werden, als murines CD22 auf Wildtypzellen. Der Phänotyp in Bezug auf die Entwicklung der B-Zellen gleicht dem der CD22-/- Maus. Das Calciumsignal nach Stimulation des BZR ist erhöht und liegt zwischen dem der Wildtyp- und dem der CD22-/- Maus. Die Huki CD22 Maus zeigt normale natürliche Antikörperlevel und reagiert auf Immunisierungen wie die Wildtypmäuse. Die Phosphorylierung der Tyrosine der drei ITIMs des CD22 und die Rekrutierung von SHP-1 scheinen noch zu funktionieren, wobei nicht klar ist, ob diese für das Signaling wichtige Schritte gleich gut funktionieren, wie bei murinem CD22 auf WT Zellen. Die CD22 knockin Mäuse mit Mutationen in der Ligandenbindungsdomäne (CD22 R130E) und in den ITIMs (CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F) wurden zunächst auf ihre natürlichen Antikörperlevel untersucht. Diese waren bei den CD22 R130E und Y2,5,6F Mäusen stark verändert. Die Y2,5,6F Mäuse zeigten stark erhöhte Level der Antikörper-Isotypen IgM und IgG1. Bei den CD22 R130E Mäusen waren die Antikörperlevel der Isotypen IgG1 und IgG2b erhöht und IgA erniedrigt. Nach Immunisierung mit dem Thymus-unabhängigen Antigen TNP-Ficoll war die IgM-Antwort der CD22 R130E Mäuse an Tag 7 und 11 nach Immunisierung signifikant erhöht, verglichen mit WT Tieren. Bei Immunisierung der verschiedenen Mauslinien mit dem Thymus-unabhängigen Antigen NP-KLH zeigten die CD22 R130E Mäuse nur schwache Abweichungen zu den WT Mäusen. So waren der IgM-Level an Tag 35 und der IgG1 Level an Tag 28 leicht erhöht. Auch die CD22 Y5,6F Mäuse zeigten nur eine Erhöhung des IgG1-Levels an Tag 7 nach der Immunisierung. Die CD22 Y2,5,6F Mäuse hatten jeweils stark erhöhte IgG1-Level nach den Immunisierungen. Sie reagierten schneller und stärker auf die Immunisierung mit NP-KLH, als die WT Tiere. Betrachtet man das Homing der B-Zellen der verschiedenen Mauslinien ins Knochenmark, so ist bei Zelltransferexperimenten gut zu erkennen, dass der Anteil der B-Zellen der CD22 Y2,5,6F Mäuse am Knochenmark der Empfängertiere reduziert ist. Dies könnte jedoch auch daran liegen, dass das Überleben oder die Proliferation dieser Zellen verringert ist. Da das Calciumsignal nach Stimulation des BZR in den CD22 R130E Mäusen reduziert ist, im Vergleich zu dem der B-Zellen von Wildtypmäusen, sollte in einem Proximity Ligation Assay die Interaktion von CD22 und dem BZR untersucht werden. Dieser Versuch zeigte, dass die Interaktion von CD22 und IgM auf unstimulierten Zellen im Vergleich zum Wildtyp signifikant erhöht ist. Nach Stimulation dieser Zellen mit Pervanadat ändert sich jedoch an der Zahl der Interaktionen von CD22 und dem BZR in diesen Mäusen nichts, während die Zahl der Interaktionen auf WT Zellen stark zunimmt.show moreshow less
  • In this study we were able to show in in vitro experiments that the immunotoxin BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA’, developed by us, could kill CD22-positive cell line cells specifically and efficiently. We were however not able to proof the efficiency of this immunotoxin in vivo. When NOD/SCID mice were injected with Nalm6 cells in a xenotransplantation model, and were then treated with the immunotoxin, we could not observe an enhanced survival of these mice. Wildtype mice treated with BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA’ generated antibodies against the immunotoxin. The amount of B cells in these mice was reduced 48 hours after treatment. We were not able to show any effect of the BPC-Neu5Ac-Dimer on the homing of thIn this study we were able to show in in vitro experiments that the immunotoxin BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA’, developed by us, could kill CD22-positive cell line cells specifically and efficiently. We were however not able to proof the efficiency of this immunotoxin in vivo. When NOD/SCID mice were injected with Nalm6 cells in a xenotransplantation model, and were then treated with the immunotoxin, we could not observe an enhanced survival of these mice. Wildtype mice treated with BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA’ generated antibodies against the immunotoxin. The amount of B cells in these mice was reduced 48 hours after treatment. We were not able to show any effect of the BPC-Neu5Ac-Dimer on the homing of the B cells. In order to investigate CD22 targeting immunotoxins and antibodies further, we generated a CD22 knockin mouse that expresses human CD22 instead of murine CD22 on the surface of B cells. The Huki CD22 mouse expresses –as expected- just the human CD22. But the human CD22 does not seem to be as strongly expressed as the murine CD22 on wildtype cells. The phenotype of the B cell development of the Huki CD22 mice resembles the phenotype of the CD22-/- mice. After stimulation of the BCR, the calcium signal of the B cells of the Huki CD22 mice is enhanced, but not as high as the one in the CD22-/- mice. The Huki CD22 mouse has normal natural antibody levels and after immunizations it reacts the same way as wildtype mice do. The tyrosine phosphorylation of the ITIMs of human CD22 after BCR stimulation and the SHP-1 recruitment to human CD22 don’t seem impaired, although we were not able to tell if they happen as efficiently as in WT mice. The natural antibody levels of the CD22 knockin mice with mutations in the ligand binding domain (CD22 R130E) or in the ITIMs (CD22 Y5,6F and CD22 Y2,5,6F) were examined. The CD22 Y2,5,6F mice showed enhanced levels of the antibody isoforms IgM and IgG1. The CD22 R130E showed enhanced levels of the isoforms IgG1 and IgG2b and reduced levels of IgA. The IgM response upon immunization with the thymus independent antigen TNP-Ficoll was significantly enhanced in the CD22 R130E mice on day 7 and 11 after immunization. When the different mouse lines were immunized with the thymus dependent antigen NP-KLH, the CD22 R130E showed a phenotype similar to the WT mice except for the IgM levels on day 35 and the IgG1 levels on day 28 which were increased. The CD22 Y5,6F mice showed an enhanced antibody response of the IgG1 isoform on day 7 after immunization. The CD22 Y2,5,6F mice showed a strong phenotype in this experiment, with significantly increased antibody responses after all three immunizations. They reacted stronger and faster after the immunizations with NP-KLH than the WT mice. An adoptive cell transfer experiment with B cells from the CD22 knockin mice lines revealed that the homing of B cells is impaired with B cells from the CD22 Y2,5,6F mice, but not with B cells of the other knockin mice. Another explanation for this finding might be impaired survival or proliferation of these cells, since the amount of the cells in the spleen of recipient mice is impaired as well. Since the B cells of the CD22 R130E mice showed a lower calcium signal after stimulation of the BCR, compared to wildtype cells, a proximity ligation assay was performed. This experiment with cells derived from CD22 R130E mice revealed that the interaction of CD22 and the BCR is stronger than in WT mice without previous stimulation of the BCR. After stimulation with Pervanadate, the number of interactions on WT B cells increased significantly; whereas the number of interactions on CD22 R130E derived B cells didn’t change.show moreshow less

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Metadaten
Author:Miriam Wöhner
URN:urn:nbn:de:bvb:29-opus-34185
Advisor:Lars Nitschke
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/07/25
Publishing Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Granting Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2012/06/29
Release Date:2012/07/25
Tag:BPC-Neu5Ac; Huki CD22; Siglecs; knockin Mauslinie
BPC-Neu5Ac; Huki CD22; Siglecs; knockin mouse line
SWD-Keyword:Acetylneuraminsäure <N->; Antigen CD22; B-Lymphozyt; B-Zell-Leukämie; Exotoxin; Immunotoxin; Systemischer Erythematodes
Institutes:Naturwissenschaftliche Fakultät / Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 13581 $