Investigating the Role of Cytokinin and Beta-1,3-Glucanases in Potato Tuber Dormancy and Sprouting

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-07-13
Issue Year
2012
Authors
Hartmann, Anja
Editor
Abstract

Potato tubers are mainly consumed fresh, generating an all year demand only to be met by long-term storage of tubers. Sprouting of tubers is an important factor for quality loss during storage, with tubers shrivelling from remobilization of storage substances and water loss. Unravelling the molecular mechanisms underlying potato tuber dormancy and sprouting is therefore of interest for both breeders and processing industries and may enable directed manipulation of dormancy length. Phytohormone measurements and treatment experiments have credited cytokinins (CKs) with a role in dormancy break. To further elucidate the role of this phytohormone, transgenic plants with altered CK biosynthesis were generated by expressing either an isopentenyltransferase (IPT) from Agrobacterium tumefaciens or an Arabidopsis thaliana CK oxidase/ dehydrogenase (CKX1) gene and analysed in detail. Strong expression of IPT, the rate-limiting enzyme of CK biosynthesis, led to bushy growth, small leaflets, inhibition of root growth and limited or absent tuber formation. Oone weakly expressing line (IPT-6), which resembled wild-type (WT) concerning plant growth and tuber yield, formed thicker and longer tuber sprouts compared to WT. In an in vitro sprouting assay (SRA), IPT-6 tubers were also shown to sprout earlier than the WT. In contrast, when CK content was lowered by expression of CKX1, transgenic plants showed reduced shoot growth, an increased number of fragile side shoots and a lower number of leaflets per leaf. CKX1 transcript abundance was inversely correlated to tuber yield and onset of sprouting. This effect was most pronounced in the strongest line (CKX1-4) which sprouted up to eight weeks later than the WT. Moreover, sprouts of CKX1-4 tubers remained diminutive after bud break and failed to initiate proper growth. In an in vitro sprouting assay using WT and CKX1-4 tubers, GA3 treatment did not initiate sprouting in the transgenic tubers. Additional transcriptional analysis of WT, IPT-6 and CKX1-4 tubers revealed that many transcripts up-regulated during GA3-mediated sprouting in WT and IPT-6 are not induced in CKX1-4 tubers. Together, these results clearly demonstrated that the presence of cytokinins is an essential requirement for the induction of tuber sprouting. Experiments with fluorescent dyes and markers have shown that meristematic cells in potato tubers are symplasmically isolated from the surrounding tissue during dormancy. In other species, symplasmic isolation was shown to result from callose deposition at plasmodesmata (PD), symplasmic connections between adjacent plant cells. To investigate whether callose deposition is an important factor of dormancy control, 34 members of the beta-1,3-glucanase (B13G) gene family encoding callose-degrading enzymes were identified in the potato genome. Comparison of available microarray data revealed several candidate genes which were up-regulated shortly before or at sprouting. Two of these candidates, termed StPdB13G_1 and StPdB13G_2, were shown to have high protein sequence similarity to a PD-located beta-1,3-glucanase of Arabidopsis thaliana (AtBG_PAP). Transgenic plants carrying an RNAi construct to silence both genes showed no phenotypical differences to the WT and during post-harvest storage, their tubers sprouted slightly, but not significantly later than WT tubers. To investigate the effects of the over-expression of a PD-located glucanase, AtBG_PAP was expressed in transgenic potatoes. This resulted in a WT-like plant phenotype and a delay in sprouting of about one week. Taken together, de-regulation of PD-glucanases seemed not to contribute greatly to tuber dormancy release. Additional evidence for this was provided by immunolocalisation of callose in WT tubers which showed no differences in callose distribution before, during and after onset of sprouting. Instead, massive formation of new vascular tissue was observed and analysis of transcription data revealed up-regulation of auxin biosynthesis and signalling pathway genes as well as markers for vascular development. These findings indicate that de novo formation of vascular bundles may support carbon allocation to meet the energy demand of cells in the newly forming sprout.

Abstract

Kartoffelknollen werden hauptsächlich frisch verzehrt, so dass ganzjährig ein Bedarf an Knollen besteht, nur durch Langzeitlagerung nach der Ernte gewährleistet werden kann. Knollenkeimung während der Lagerung ist ein Hauptfaktor für Qualitätsverlust, da die Kartoffeln durch Remobilisierung von Speicherstoffen und Wasserverlust zusammenschrumpfen. Das Verständnis der molekularen Prozesse, die dem Keimungsprozess zugrunde liegen, ist daher sowohl für Züchter als auch für die verarbeitenden Industriezweige von entscheidender Bedeutung und könnte in Zukunft die gezielte Manipulation der Dormanzlänge ermöglichen. Bisherige Forschungsergebnisse haben Cytokininen (CK) eine Rolle bei der Brechung der Keimruhe zugeschrieben. Um die Rolle von CK näher zu untersuchen wurden transgene Pflanzen mit erhöhtem oder verringertem CK- Gehalt analysiert. Starke Expression einer Isopentenyltransferase (IPT), dem Schlüsselenzym der CK Biosynthese, führte zu dem „typischen“ CK-responsiven Phänotyp mit buschigem Wuchs, stark verkleinerten Blättchen, einem gehemmten Wurzelwachstum und limitierter bis ausbleibender Knollenbildung. Knollen einer schwach exprimierenden Linie (ITP-6), die in Wachstum und Ertrag dem Wildtyp (WT) glich, konnten weiter analysiert werden. IPT-6 Knollen bildeten im Vergleich zum WT dickere und längere Keime und keimten einem in vitro Keimungsexperiment (SRA) früher als WT Knollen. Im Gegensatz dazu führte die Verringerung des CK-Gehalts in transgenen Kartoffelpflanzen durch Expression des katabolischen Enzyms CKX1 (Cytokinin Oxidase/ Dehydrogenase1) zu reduziertem Wuchs, Verringerung der apikalen Dominanz und einer geringeren Anzahl an Fiederblättchen in den Blättern. Die CKX1 Transkriptmenge korrelierte zudem negativ mit Knollenertrag und einer Verzögerung der Keimung, die in der stärksten Linie (CKX1-4) bis zu acht Wochen später einsetzte als in WT Knollen. Ferner blieben die Keime der CKX1-4 Knollen nach Beginn der Keimung winzig und ein weiteres Wachstum blieb aus Die Keimung der transgenen CKX1-4 Knollen konnte im Gegensatz zu WT Knollen nicht durch GA3-Behandlung induziert werden. Die transkriptionelle Analyse der CKX1-4, IPT-6 und WT Knollen offenbarte, dass viele Transkripte, die während der GA3-induzierten Keimung im WT und in IPT-6 hochreguliert werden, in den CKX1-4 Knollen nicht induziert werden. Zusammen genommen belegen diese Ergebnisse, dass das Vorhandensein von CK eine notwendige Voraussetzung für das Einsetzen der Keimung ist. Experimente mit Fluoreszenz-Farbstoffen und -Markern zeigten, dass die Knollenmeristeme während der Dormanz vom umgebenden Gewebe symplastisch isoliert sind. Wie aus anderen Spezies bekannt, resultiert diese Isolation meist aus Callose-Ablagerungen an den Plasmodesmata, den pflanzlichen Zell-Zell-Verbindungen. Um die Funktion der Callose während der Keimruhe näher zu bestimmen, wurde die Genfamilie der Beta-1,3-Glucanasen (B13G), die Callose- abbauende Enzyme kodieren, in Kartoffel näher charakterisiert. 34 Gene dieser Genfamilie wurden im Kartoffelgenom identifiziert und durch den Vergleich von vorhandenen Microarray-Daten konnten mehrere Kandidaten eingegrenzt werden, die kurz vor oder bei Einsetzen der Keimung hochreguliert waren. Für zwei dieser Kandidaten, StPdB13G_1 und StPdB13G_2, konnte gezeigt werden, dass sie auf Proteinebene eine hohe Sequenzähnlichkeit zu einer PD-assoziierten β-1,3-Glucanase aus Arabidopsis thaliana (AtBG_PAP) aufweisen. Transgene Pflanzen, die ein RNAi-Konstrukt zur Herunterregulation beider Gene trugen, unterschieden sich phänotypisch nicht vom WT, aber nach der Ernte keimten die Knollen geringfügig, aber nicht signifikant, später als die des Wildtyps. Um den Effekte der Überexpression einer PD-lokalisierten Glucanase zu untersuchen, wurde AtBG_PAP in transgenen Kartoffeln exprimiert. Dies führte zu einem WT-ähnlichem Phänotyp und einem um etwa eine Woche verzögerten Einsetzen der Keimung. Zusammengenommen scheint die Veränderung der Expression von PD-Glucanasen nicht im vermuteten Maße Einfluss auf die Länge der Keimruhe zu nehmen. Einen zusätzlichen Hinweis dafür lieferte die Immunolokalisation von Callose in WT Knollen während eines Keimungsexperiments. Über einen Zeitraum von mehreren Tagen nach GA3- Behandlung wurden keine Unterschiede in der Callose-Verteilung vor, während und nach Einsetzen der Keimung beobachtet. Stattdessen konnte im selben Zeitraum die massive Bildung von neuem vaskulärem Gewebe beobachtet werden und die Analyse von Transkriptdaten offenbarte, dass Gene des Auxin-Metabolismus und -Signalweges sowie Marker für vaskuläre Entwicklung während der Keimung hochreguliert werden. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass de novo Bildung von Leitgewebe die Nährstoff-Umverteilung zur Deckung des Energiebedarfs der Zellen im neu gebildeten Keim unterstützt.

DOI
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