Epigenetisches Silencing von endogenen Inhibitoren des WNT-Signalweges durch Promoter Methylierung in der Systemischen Sklerose

Epigenetic silencing of endogenous inhibitors of the WNT-pathway caused by promoter methylation in Systemic Sclerosis

  • 1. Hintergrund und Ziele Die Systemische Sklerose (SSc) ist eine seltene Erkrankung des Bindegewebes und gehört zur Familie der Autoimmunkrankheiten. Die SSc zeigt eine starke klinische Variabilität, charakteristisch ist jedoch eine Trias aus Fibrose, Entzündung und Gefäßveränderungen. Man unterscheidet zwischen einer limitiert-kutanen und einer diffus-kutanen SSc. Die lcSSc hat eine bessere Prognose, da dieser Subtyp langsamer fortschreitet, nur selten eine Beteiligung der inneren Organe zeigt und die Hautfibrose nur distale Partien des Köpers betrifft. Die dcSSc hingegen ist mit einer raschen Progression, einer Hautfibrose in allen Teilen des Körpers, wie z.B. dem Körperstamm, dem Gesicht 1. Hintergrund und Ziele Die Systemische Sklerose (SSc) ist eine seltene Erkrankung des Bindegewebes und gehört zur Familie der Autoimmunkrankheiten. Die SSc zeigt eine starke klinische Variabilität, charakteristisch ist jedoch eine Trias aus Fibrose, Entzündung und Gefäßveränderungen. Man unterscheidet zwischen einer limitiert-kutanen und einer diffus-kutanen SSc. Die lcSSc hat eine bessere Prognose, da dieser Subtyp langsamer fortschreitet, nur selten eine Beteiligung der inneren Organe zeigt und die Hautfibrose nur distale Partien des Köpers betrifft. Die dcSSc hingegen ist mit einer raschen Progression, einer Hautfibrose in allen Teilen des Körpers, wie z.B. dem Körperstamm, dem Gesicht und den Extremitäten, und einem lebensgefährlichen fibrotischen Gewebsumbau in den inneren Organen, vor allem der Lunge, der Leber, dem Herz, der Nieren oder dem Gastrointestinaltrakt, assoziiert. Die pathogenetischen Hintergründe, welche zu einer Manifestation der SSc führen, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Es konnte jedoch eine aberrante Aktivierung von Fibroblasten als zentraler Mechanismus identifiziert werden, wodurch es zu einer exzessiven Produktion von extrazellulärer Matrix kommt. Epigenetische Modifikationen sind an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt, wie beispielsweise dem kolorektalen Karzinom. Eine fehlerhafte epigenetische DNA-Methylierung von Cytosin-Residuen in CpG-Inseln in Promoterregionen verursacht eine Unterdrückung der Genexpression und greift auf diese Weise in die Regulation von Signalkaskaden, wie dem WNT-Signalweg, ein. Das epigenetische Silencing wichtiger Suppressoren des WNT-Signalweges führt daher zu einer Aktivierung der WNT-Signalkaskade und stimuliert die Fibroblasten zur Freisetzung von Kollagen. Da epigenetische Modifikationen für die Pathogenese der SSc von großer Bedeutung sein könnten, wurde für diese Doktorarbeit ein potentielles Silencing von fünf Inhibitoren des WNT-Signalweges bei SSc-Patienten analysiert und ihre Bedeutung für die Entwicklung der pathologischen Fibrose in der SSc evaluiert. Untersucht wurden die Gene der Proteine DKK1, DKK2 und DKK3 aus der Dickkopf-Familie sowie SFRP1 und WIF1 aus der Familie der SFRP-Proteine. 2. Methoden Von 76 Patienten mit SSc und der gleichen Anzahl gesunder Kontrollen wurden Blutproben entnommen und die genomische DNA aus den Leukozyten isoliert. Es kam die Methode der DNA-Modifikation zum Einsatz, bei welcher durch die Anwendung von Bisulfit Cytosin-Residuen gezielt desaminiert werden können. Anschließend wurde eine methylierungsspezifische Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt um die modifizierte DNA zu vervielfältigen. Durch die Methode der Gelelektrophorese wurden die DNA-Fragmente aufgetrennt, die modifizierte DNA mittels einer Fluoreszenz unter UV-Licht sichtbar gemacht und mit einer Kamera fotografiert. Mit Hilfe eines speziellen Programmes konnten Helligkeitsunterschiede exakt ausgemessen werden. Anhand dieser Ergebnisse wurden potentielle Auffälligkeiten im Methylierungsstatus der SSc-DNA untersucht. 3. Ergebnisse und Beobachtungen Die Analyse der Daten zeigte relevante Veränderungen im Methylierungsstatus der DNA von SSc-Patienten, verglichen mit der Kontrollgruppe. So konnte eine signifikante Hypermethylierung in den Promoterregionen der Gene Dkk1, Sfrp1 und Wif1 bei der SSc-DNA nachgewiesen werden, wodurch ein Silencing der WNT-Inhibitor-Proteine DKK1, SFRP1 und WIF1 verursacht wird. Eine Korrelation zwischen dem jeweiligen Methylierungsstatus und den erhobenen klinischen und serologischen Charakteristika der SSc-Kohorte konnte nicht gefunden werden. 4. Praktische Schlussfolgerungen In dieser Doktorarbeit konnte die Bedeutung von epigenetischen Modifikationen als zentraler Mechanismus für die Fibroblastenaktivierung in der Pathogenese der SSc hervorgehoben werden. Die signifikante Hypermethylierung der Promoter von Dkk1, Sfrp1 und Wif1 und der damit verbundene Verlust der hemmenden Wirkung auf WNT führt zu einer Aktivierung des WNT-Signalweges, fördert somit die Produktion und Freisetzung von Kollagen und ist daher direkt in die Entwicklung der pathologischen Fibrose bei der SSc involviert. Diese Erkenntnis könnte direkte Konsequenzen für die Therapie der SSc haben, da Medikamente mit demethylierender Wirkung bereits seit vielen Jahren in der Behandlung von anderen Erkrankungen eingesetzt werden, wie beispielsweise 5-Azacytidin in der Therapie des Myelodysplastischen Syndroms. Diese Gruppe von Medikamenten könnte eine weitere Option für die Behandlung der SSc darstellen und in ersten klinischen Experimenten konnten bereits gute Resultate erzielt werden, jedoch müssen noch weitere Studien in diese Richtung durchgeführt werden.show moreshow less
  • 1. Objective Systemic sclerosis (SSc) is a rare connective tissue disease belonging to the family of autoimmune diseases. As its clinical appearance may vary, the SSc is characterised by a triad of fibrosis, inflammation and vascular alterations. A difference can be made between a limited-cutaneous and diffuse-cutaneous SSc. Whereas the lcSSc is associated with a better prognosis, due to slower progression, low rates of involvement of internal organs and a skin fibrosis affecting only distal parts of the body, the clinical hallmarks of dcSSc are rapid progression, skin fibrosis in all parts of the trunk, face and extremities and life-threatening fibrotic tissue remodelling of internal organs1. Objective Systemic sclerosis (SSc) is a rare connective tissue disease belonging to the family of autoimmune diseases. As its clinical appearance may vary, the SSc is characterised by a triad of fibrosis, inflammation and vascular alterations. A difference can be made between a limited-cutaneous and diffuse-cutaneous SSc. Whereas the lcSSc is associated with a better prognosis, due to slower progression, low rates of involvement of internal organs and a skin fibrosis affecting only distal parts of the body, the clinical hallmarks of dcSSc are rapid progression, skin fibrosis in all parts of the trunk, face and extremities and life-threatening fibrotic tissue remodelling of internal organs, such as lung, liver, heart, kidney or intestinal tract. Little is known about the pathogenetic origins leading to a manifestation of SSc but it is now clear that aberrant activation of fibroblasts, leading to excessive production of extracellular matrix, is a central mechanism in the development of fibrosis. Epigenetic modifications are involved in the pathogenesis of different diseases, like colorectal cancer. Aberrant epigenetic DNA-methylation of cytosine residues in CpG-islands in promoter regions causes inhibition of gene expression and may affect the regulation of signalling pathways, such as the WNT-pathway. Epigenetic silencing of important suppressors of the WNT-pathway leads to WNT-activation and stimulates fibroblasts to release collagen. As the importance of epigenetic modifications in the pathogenesis of SSc is of central interest, this doctoral thesis analyses a potential silencing of five suppressors of the WNT-pathway, the Dickkopf-family proteins DKK1, DKK2 and DKK3 and the SFRP-family members SFRP1 and WIF1, and evaluates their impact on the development of pathological fibrosis in SSc. 2. Methods Genomic DNA was isolated out of leucocytes from blood samples of 76 SSc-patients and 76 healthy controls. The method of DNA-modification, using bisulfite to selectively deaminate cytosine residues, was followed by a methylation-specific polymerase-chain-reaction to amplify the modificated DNA. With electrophoresis-technology the DNA fragments were separated and pictures were taken using ultraviolet light, visualizing the modified DNA by added fluorescence. The integrated density was measured utilizing a special program. With these results a potential difference in the methylation status of SSc-DNA and control-DNA was investigated. 3. Results The analysis revealed relevant changes concerning the methylation status in DNA of SSc-Patients compared to the control group. A significant hypermethylation in promoter regions of Dkk1, Sfrp1 and Wif1 in SSc-DNA was discovered, leading to silencing of the WNT-suppressor proteins DKK1, SFRP1 and WIF1. No correlation was found between the methylation status and the clinical and serological characteristics of the SSc-cohort. 4. Conclusion This doctoral thesis succeeded in emphasising the importance of epigenetic modifications as a central mechanism in fibroblast activation and therefore in the pathogenesis of Systemic Sclerosis. The significant hypermethylations in promoters of Dkk1, Sfrp1 and Wif1 and the loss of their inhibiting influence on WNT cause an activation of the WNT-pathway, forcing production and release of collagen, thus being directly involved in development of pathologic fibrosis in SSc. This relevation might have therapeutical implications as demethylating drugs are already established for daily use in treatment of other diseases, e.g. 5-azacytidine in the therapy of myelodysplastic syndromes. These drugs might be a possibility for SSc-treatment as well and first clinical experiments showed good results in reducing SSc fibrosis, but further trials have to be made.show moreshow less

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Metadaten
Author:Robin Funke
URN:urn:nbn:de:bvb:29-opus-33581
Advisor:Jörg Distler
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/07/04
Publishing Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Granting Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Medizinische Fakultät
Date of final exam:2012/06/20
Release Date:2012/07/04
Tag:Scleroderma; Wnt-proteins; case-control-study; epigenetics; methylation; polymerase chain reaction; promoter; silencing
SWD-Keyword:Epigenetik; Fall-Kontroll-Studie; Geninaktivierung; Methylierung; Polymerase-Kettenreaktion; Promotor <Genetik>; Sklerodermie; Wnt-Proteine
Institutes:Medizinische Fakultät / Medizinische Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit

$Rev: 13581 $