Epstein-Barr Virus Rta Activation of Lytic Gene Promoters and its Regulation by the Viral LF2 Protein

Die Aktivierung lytischer Epstein-Barr-Virus Genpromotoren durch den Transkriptionsfaktor Rta und ihre Regulation durch das virale Protein LF2

  • The switch from Epstein-Barr virus (EBV) latent infection to lytic replication is governed by two essential transactivators, Zta and Rta. Rta activates many EBV promoters through direct binding to cognate DNA sites termed Rta response elements (RREs). Rta can also activate promoters that apparently lack Rta binding sites, most notably the promoters driving Zta and Rta expression, Zp and Rp. The lytic EBV protein LF2 has previously been found to associate with Rta, block EBV replication and inhibit Rta promoter activation. The first part of this thesis investigates LF2 regulation of Rta promoter activation. It shows that LF2 specifically inhibits Rta activation of RRE promoters, but allows acThe switch from Epstein-Barr virus (EBV) latent infection to lytic replication is governed by two essential transactivators, Zta and Rta. Rta activates many EBV promoters through direct binding to cognate DNA sites termed Rta response elements (RREs). Rta can also activate promoters that apparently lack Rta binding sites, most notably the promoters driving Zta and Rta expression, Zp and Rp. The lytic EBV protein LF2 has previously been found to associate with Rta, block EBV replication and inhibit Rta promoter activation. The first part of this thesis investigates LF2 regulation of Rta promoter activation. It shows that LF2 specifically inhibits Rta activation of RRE promoters, but allows activation of Zp or Rp. Coexpression studies revealed that Rta is redistributed from the nucleus to the extranuclear cytoskeleton in the presence of LF2. LF2 binding to the Rta carboxy-terminus was critical for Rta redistribution and inhibition. Rta localization changed during replication of the LF2-positive P3HR1 genome, but not during replication of the LF2-negative B95-8 genome. These data support a model in which LF2 regulates Rta promoter activation, and therefore EBV replication, by binding Rta and redistributing it out of the nucleus. As Zp or Rp activation is not inhibited by LF2, LF2 provides a means by which the two modes of Rta lytic promoter activa-tion may be differentially regulated. The second part of this thesis identifies Rta binding sites throughout the EBV genome. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of endogenous Rta during the early replication cycle resulted in strong enrichment of known RREs, but little or no enrichment for Rp and Zp, sug-gesting that the Rta ChIP approach enriches for direct Rta binding sites. Rta ChIP combined with deep sequencing (ChIP-seq) identified most known RREs and several novel Rta binding sites. Rta ChIP-seq peaks were frequently upstream of Rta-responsive genes, indicating that these Rta binding sites are likely RREs. This hypothesis was investigated for the EBV DNA polymerase promoter (BALF5p), which had previously been reported to be indirectly activated by Rta. BALF5p was bound by Rta and its activation was abrogated by a mutation in the Rta DNA binding domain (K156A), which abolished DNA binding and RRE activation. Rta binding to late gene promoters was not seen during the early replication cycle, but was specifically detected during the late cycle in two Rta-responsive late promoters. These results represent the first genome-wide analysis of Rta DNA binding during EBV replication, identify previously unknown RREs, such as the BALF5p RRE, and highlight the complexity of EBV late gene regulation.show moreshow less
  • Die aktive Vermehrung (lytische Replikation) des Epstein-Barr-Virus (EBV) wird von zwei Transkriptionsfaktoren, Zta und Rta, kontrolliert. Diese schalten die Transkription von viralen lytischen Genen an, die stufenweise exprimiert werden. Rta aktiviert einige lytische Gene, in-dem es im Zellkern direkt an DNA in ihren Promotoren bindet. Da diese DNA-Bindungsstellen die Aktivierung der nachgeschalteten Gene vermitteln, werden sie Rta responsive Elemente (RRE) genannt. Außerdem aktiviert Rta lytische Promotoren, die keine Rta-Bindungsstellen aufweisen, zum Beispiel Zp und Rp, die die Expression von Zta und Rta regulieren. Das lytische EBV-Protein LF2 interagiert mit Rta, inhibiert virale RepliDie aktive Vermehrung (lytische Replikation) des Epstein-Barr-Virus (EBV) wird von zwei Transkriptionsfaktoren, Zta und Rta, kontrolliert. Diese schalten die Transkription von viralen lytischen Genen an, die stufenweise exprimiert werden. Rta aktiviert einige lytische Gene, in-dem es im Zellkern direkt an DNA in ihren Promotoren bindet. Da diese DNA-Bindungsstellen die Aktivierung der nachgeschalteten Gene vermitteln, werden sie Rta responsive Elemente (RRE) genannt. Außerdem aktiviert Rta lytische Promotoren, die keine Rta-Bindungsstellen aufweisen, zum Beispiel Zp und Rp, die die Expression von Zta und Rta regulieren. Das lytische EBV-Protein LF2 interagiert mit Rta, inhibiert virale Replikation und die Rta-abhängige Aktivierung viraler Promotoren. Der erste Teil dieser Arbeit untersucht, wie Rta von LF2 reguliert wird. LF2 inhibierte spezi-fisch die Aktivierung von RRE-abhängigen Promotoren, aber nicht von Zp oder Rp. Koexpression von Rta und LF2 führte zur Umverteilung von Rta aus dem Zellkern zum Zytoskelett ausserhalb des Zellkerns. Es wurde gezeigt, dass die Bindung an LF2 sowohl für die Inhibition als auch für die Umverteilung von Rta notwendig ist. Die Umverteilung von Rta wurde beobachtet während der Replikation eines LF2-positiven Viruses (P3HR1), aber nicht waehrend der Replikation eines LF2-negativen Viruses (B95-8). Diese Daten legen nahe, dass das LF2 Protein die transkriptionelle Aktivität von Rta und damit auch die Replikation von EBV reguliert, indem es an Rta bindet und es aus dem Zellkern verteilt. LF2 könnte es Rta somit ermöglichen, verschiedene lytische Promotoren geziehlt zu aktivieren. Der zweite Teil dieser Arbeit identifiziert Rta-Bindungsstellen im EBV-Genom. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) von endogenem Rta in der frühen lytischen Phase reicherte be-reits bekannte RREs an. Da ein hingegen nur vergleichsweise geringer Teil von Zp oder Rp mit Rta präzipitiert wurde, kann geschlossen werden, dass die angewandte Rta ChIP-Methode vor allem direkte Interaktionen von Rta mit DNA erfasst. Die Sequenzierung von Rta ChIP-assozierter DNA identifizierte neue Rta-DNA-Bindungsstellen. Diese waren häufig Zielgenen von Rta vorgeschaltet und fungieren daher wahrscheinlich als RREs. Dies wurde am Beispiel des Promotors des viralen DNA-Polymerasegens (BALF5) und mittels einer Rta Mutante (K156A) getestet, die RRE-abhängige Promotoren nicht aktivieren kann. Zudem wurde gezeigt, dass Rta zwei Rta-abhängige späte Promotoren in der späten Phase, nicht aber in der frühen Phase, bindet. Die hier vorgelegte genom-weite Analyse von Rta-DNA-Bindungsstellen identifiziert neue RREs in frühen Genen, wie z. B. in BALF5, und unterstreicht die komplexe Regulation von späten Genen.show moreshow less

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Metadaten
Author:Andreas Heilmann
URN:urn:nbn:de:bvb:29-opus-31291
Advisor:Jutta Eichler
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/03/09
Publishing Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Granting Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2012/02/10
Release Date:2012/03/09
Tag:BRLF1; ChIP-seq; Chromatinimmunoprezipitation; LF2; Rta
BRLF1; ChIP-seq; LF2; Rta
SWD-Keyword:DNS-Bindung; Epstein-Barr-Virus; Genregulation; Promotor <Genetik>; Replikation; Transkriptionsfaktor
Institutes:Naturwissenschaftliche Fakultät / Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 13581 $