Development of innovative bioassay principles for pharmaceutical quality control

Entwicklung innovativer Bioassayprinzipien für die pharmazeutische Qualitätskontrolle

  • The quality of biopharmaceuticals is usually monitored by using biological assays. The aim of this study was to optimize existing methods for biological assays and to implement alternative assay formats. First, analysis models and read-out systems for proliferation assays, which are frequently applied for quality control purposes, were compared. Regarding the comparison of analysis models, the parallel line model was compared to the logistic models four- and five-parameter fit. The results of this comparison revealed a slightly better accuracy and precision of the logistic models in comparison to the parallel line model; however differences were not statistically significant different. On thThe quality of biopharmaceuticals is usually monitored by using biological assays. The aim of this study was to optimize existing methods for biological assays and to implement alternative assay formats. First, analysis models and read-out systems for proliferation assays, which are frequently applied for quality control purposes, were compared. Regarding the comparison of analysis models, the parallel line model was compared to the logistic models four- and five-parameter fit. The results of this comparison revealed a slightly better accuracy and precision of the logistic models in comparison to the parallel line model; however differences were not statistically significant different. On the other side, the logistic models showed a significantly higher failure rate. Regarding the comparison of read-out systems, it was tested in this study, whether luminescence or fluorescence systems could be of advantage in comparison to the colorimetric system, originally in use for detection of the response of proliferation assays at Merck Serono. From the results of this study, it can be concluded that the luminescence technique seems to be the most advantageous of the three read-outs for potency assays. It is extremely sensitive, therefore leading to cell savings and provides the highest signal to noise ratios, leading to very precise results. Moreover, it is the fastest of the three methods for all assays investigated (CTLL-2, DiFi and Kit 225 potency assay), since the plate can already be measured 5 - 10min after addition of substrate. As an alternative to the commonly used proliferation assays, an intracellular phosphorylation assay was developed for a cytokine fusion protein including Interleukin (IL)-7, since the originally used proliferation assay suffered from a very long incubation time and a poor robustness. Using western blotting, STAT5 was identified as a target for development of this assay. This study was further expanded to a comparison of IL-7 signaling in different cell lines (Kit 225, PB-1 and 2E8) and to a comparison between the signaling pathways of the two γc cytokines IL-7 and IL-2. The study showed that some of the investigated targets were induced by IL-2 stimulation only, and not by IL-7 stimulation. Regarding the comparison between the different cell lines, interesting differences in the expression pattern and kinetics of activation by IL-7 could be observed. However, in this study, the only pathway identified to be activated in all three cell lines by IL-7, was the STAT5 pathway and the associated induction of pim-1, making STAT5 a suitable target for development of the phosphorylation assay and the IL-7 signal transduction cascade an interesting target for further explorations. The developed STAT5 phosphorylation assay showed very accurate and precise results. The main advantage of this assay are its rapidness - reducing the total time of the assay from six to three days – and the higher robustness in comparison to the proliferation assay. It can serve as a fast and reliable alternative to classical end-point assays and is well-suited for use in quality control of biopharmaceuticals.show moreshow less
  • Die Qualität von Biopharmazeutika wird üblicherweise durch Bioassays kontrolliert. Das Ziel dieser Arbeit war, bestehende Methoden für Bioassays zu optimieren und alternative Assayformate zu implementieren. Zunächst wurden Auswertemethoden und Read-out Systeme für Proliferationsassays, die häufig für Qualitätskontrollzwecke eingesetzt werden, miteinander verglichen. Hinsichtlich des Vergleichs von Auswertemodellen wurde das Parallel Line Model mit den beiden logistischen Modellen, Vier- und Fünf-Parameter Fit verglichen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten eine etwas höhere Genauigkeit und Präzision der logistischen Modelle im Vergleich zum Parallel Line Model; die Unterschiede waren jedochDie Qualität von Biopharmazeutika wird üblicherweise durch Bioassays kontrolliert. Das Ziel dieser Arbeit war, bestehende Methoden für Bioassays zu optimieren und alternative Assayformate zu implementieren. Zunächst wurden Auswertemethoden und Read-out Systeme für Proliferationsassays, die häufig für Qualitätskontrollzwecke eingesetzt werden, miteinander verglichen. Hinsichtlich des Vergleichs von Auswertemodellen wurde das Parallel Line Model mit den beiden logistischen Modellen, Vier- und Fünf-Parameter Fit verglichen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten eine etwas höhere Genauigkeit und Präzision der logistischen Modelle im Vergleich zum Parallel Line Model; die Unterschiede waren jedoch statistisch nicht signifikant. Andererseits waren die Fehlerraten der logistischen Modelle signifikant höher. Für den Vergleich verschiedener Read-out Systeme wurde in dieser Studie getestet, ob Lumineszenz oder Fluoreszenz Systeme vorteilhaft gegenüber dem kolorimetrischen System sind, das bei Merck Serono ursprünglich für die Detektion der Antwort von Proliferationsassays verwendet wurde. Aus den Ergebnissen dieser Studie kann geschlussfolgert werden, dass die Lumineszenztechnik die vielversprechendste der drei Read-out Methoden für Bioassays ist. Sie ist extrem sensitiv und mindert somit den Verbrauch an Zellen, liefert die höchsten Signal-Rausch-Verhältnisse und führt zu sehr präzisen Resultaten. Außerdem ist sie die schnellste der drei Methoden für alle untersuchten Assays (CTLL-2, DiFi und Kit 225 Assay), da die Platte bereits 5 - 10min nach Substratzugabe gemessen werden kann. Als Alternative zu den allgemein verwendeten Proliferationsassays wurde ein intrazellulärer Phosphorylierungsassay für ein Zytokinfusionsprotein mit Interleukin (IL)-7 Anteil entwickelt, da die Inkubationszeit des ursprünglichen Proliferationsassays sehr lang war und die Robustheit des Assays nicht angemessen war. Mittels Westernblotanalyse wurde STAT5 als Target für diesen Assay identifiziert. Diese Studie wurde ausgeweitet zu einem Vergleich der IL-7 Signaltransduktionswege in verschiedenen Zelllinien (Kit 225, PB-1 und 2E8) und zu einem Vergleich der Signaltransduktionswege der beiden γc Zytokine, IL-7 und IL-2. Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass einige der untersuchten Targets nur durch IL-2 Stimulation und nicht durch IL-7 Stimulation induziert wurden. In den verschiedenen Zelllinien konnten interessante Unterschiede der Expressionsmuster und Aktivierungskinetiken durch IL-7 beobachtet werden. Jedoch war der einzige, identifizierbare Signaltransduktionsweg, der in dieser Studie durch IL-7 aktiviert wurde, der STAT5 Signalweg und die damit verbundene Induktion von Pim-1. Dies machte STAT5 zu einem geeigneten Target für die Entwicklung eines Phosphorylierungsassays und die IL-7 Signaltransduktionskaskade zu einem interessanten Ziel für weitere Untersuchungen. Der entwickelte STAT5 Phosphorylierungsassay zeigte sehr genaue und präzise Ergebnisse. Die wesentlichen Vorteile dieses Assays sind seine Schnelligkeit – da die Gesamtdauer des Assays von sechs auf drei Tage reduziert werden konnte – und die höhere Robustheit im Vergleich zum Proliferationsassay. Er ist somit eine schnelle und zuverlässige Alternative im Vergleich zu den klassischen Proliferationsassays und ist gut geeignet für die Qualitätskontrolle von Biopharmazeutika.show moreshow less

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Metadaten
Author:Cornelia Zumpe
URN:urn:nbn:de:bvb:29-opus-21669
Advisor:Monika Pischetsrieder
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2010/12/07
Publishing Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Granting Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2010/11/26
Release Date:2010/12/07
Tag:Bioassay; Interleukin-7; STAT5 phosphorylation assay; analysis models; quality control; read-out systems
SWD-Keyword:Auswertemodelle; Bioassay; Interleukin-7; Qualitätskontrolle; Read-out Systeme; STAT5 Phosphorylierungsassay
Institutes:Naturwissenschaftliche Fakultät / Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 50 Naturwissenschaften / 500 Naturwissenschaften und Mathematik
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES

$Rev: 13581 $