Systematic analysis of regulatory functions of genomic fragments identified by immunoprecipitations of Tinman-bound chromatin from Drosophila embryos

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-12-04
Issue Year
2012
Authors
Jin, Hong
Editor
Abstract

Heart and muscle formation from the dorsal mesoderm of Drosophila melanogaster has become a highly favorable and informative model system for understanding how signal molecules and transcription factors cooperate to achieve particular developmental events. The NK homeodomain transcription factor tinman (tin) is a key regulator of heart and muscle development from dorsal mesoderm in Drosophila. In the absence of tin function, there is a complete loss of all dorsal mesodermal derivatives, including cardiac, visceral and somatic muscles. Across the metazoan phyla, orthologs of tin play an essential role in heart development. To better understand the functions of tin in the regulatory network of heart and muscle development, I performed whole-genome ChIP-on-chip analysis for Tin in vivo binding sites with embryos of two distinct developmental periods, which cover early induction of various dorsal mesoderm muscle progenitors and specific ventrolateral muscle founder cells, as well as the specification and diversification of cardiac cells. Among the about 3500 partially overlapping Tin-bound regions from these two time windows, several dozens of prioritized regions were chosen for analysis of their regulatory functions in both wild type and tin mutant embryos. The results show that most Tin-bound regions tested are able to function as active mesoderm enhancers and the regulatory activities of tested cardiac enhancers completely depend on the presence of functional Tin protein. In addition, mutation analysis of binding sites for Tin, as well as for the cardiogenic factors Pnr and Doc in the six cardiac enhancers tested shows that these enhancers display differential in vivo requirements for the binding motifs of the three factors, and that functional redundancy can exist among these cardiogenic factors. Furthermore, I demonstrated the in vivo functional relevance of the ATT[TG]CC motifs, which were found to be enriched in the tested cardiac enhancers by de-novo motif discovery. In connection with these studies, I determined the DNA binding target sequences of the T-box transcription factors Doc, Mid, and Org-1, which play key roles in the development of cardiac and somatic muscles frequently together with Tin, through in vitro oligonucleotide selection assays, and examined Tin-associated cis-regulatory elements at the Doc locus.

Abstract

Die Herz- und Muskelbildung aus dem dorsalen Mesoderm von Drosophila melanogaster stellt ein besonders geeignetes und informatives Modellsystem zur Untersuchung der Kooperation von Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren bei Entwicklungsvorgängen dar. Der NK-Homeodomänen-Transkriptionsfaktor tinman (tin) spielt bei diesem Vorgang eine entscheidende Rolle. Die Abwesenheit der tin Funktion in Drosophila führt zum kompletten Verlust aller Derivate des dorsalen Mesoderms, einschließlich der kardialen, viszeralen und somatischen Muskulatur. Auch in anderen Metazoenstämmen spielen Orthologe von Tin eine wesentliche Rolle bei der Herzentwicklung. Zum besseren Verständnis der Funktionen von tin innerhalb der regulatorischen Netzwerke der Herz- und Muskelentwicklung führte ich genomweite ChIP-on-Chip-Analysen für in-vivo-Bindungsstellen von Tinman mit Embryonen zweier unterschiedlicher Entwicklungsstadien durch. Diese Stadien deckten die tin-abhängigen Vorgänge der frühen Induktion verschiedener dorsaler Muskelvorläuferzellen, distinkter ventrolateraler Muskelgründerzellen, sowie die Determinierung und die Diversifizierung der Herzzellen im dorsalen Mesoderm ab. Unter den etwa 3500 teilweise miteinander überlappenden Tin-assoziierten Regionen aus diesen beiden Zeitfenstern wurden mehrere dutzend Regionen für die Analyse ihres regulatorischen Potentials sowohl im Wildtyp als auch in tin Mutanten ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten, dass die meisten der getesteten Tin-gebundenen Regionen in der Lage sind, als aktive Mesoderm-Enhancer zu fungieren, und dass die regulatorische Aktivität der getesteten kardialen Enhancer vollständig vom Vorhandensein von funktionellem Tin Protein abhängt. Darüber hinaus konnte ich durch Mutationsanalysen der Bindestellen für Tin sowie für zwei weitere kardiogene Faktoren, Pannier (Pnr) und Dorsocross (Doc), in sechs kardialen Enhancern zeigen, dass die Bindungsmotive der drei Faktoren in diesen Enhancern unterschiedliche in vivo Relevanz besitzen und dass in einigen Fällen eine funktionelle Redundanz zwischen diesen kardiogenen Faktoren existiert. Ebenfalls konnte ich eine regulatorische Funktion der ATT[TG]CC Motive in vivo nachzuweisen, welche durch de novo Motivsuche auf Grund ihrer Anreicherung in den getesteten kardialen Enhancern identifiziert wurden. Im Zusammenhang mit diesen Untersuchungen charakterisierte ich außerdem durch in vitro Oligonukleotid-Bindungsanalysen (SELEX) die DNA-Bindemotive der T-Box Transkriptionsfaktoren Doc, Midline und Org-1, die zusammen mit Tin Schlüsselrollen bei der Entwicklung von Herz- und somatischer Muskulatur spielen, und untersuchte Tin-assoziierte cis-regulatorische Elemente am Dorsocross Locus.

DOI
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