Proteincharakterisierung am Beispiel von Apoptosemodulation durch Pockenviren und der Glykosylierung in Insektenzellen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-07-30
Issue Year
2011
Authors
Bartel, Sebastian
Editor
Abstract

Despite the successful eradication of smallpox by the WHO, pox virus infections remain a considerable health threat. The possible use as a bioterrorism agent as well as the continuous occurrence of zoonotic pox virus infections document the relevance to understand virus host interactions. Since the permissiveness of pox infections is independent of hosts surface receptors, but correlates with the ability of the virus to infiltrate the antiviral host response, it directly depends on the hosts proteome set. For this the proteome of HEK 293 cells infected with active and UV-inactivated Vaccinia Virus strain IHD W was analyzed by 2-D gel electrophoresis and MALDI-ToF MS in a top-down approach. In the early stages of the project an optimized 4-Sulfophenyl isothiocyanate (SPITC) ZipTipµ-C18 solid phase support based peptide derivatization strategy was developed to improve protein identification rates by obtaining sequence data of selected peptides in post source decay mode. The improved s/n ratio and the increased signal intensity of the solid phase established supported approach in PSD mode enlarges the coverage of the precursor ions y-series. The s/n ratios of m/z values used for identification were 4 times and the overall signal intensity was 7 times higher for peptides derivatized on solid phase than for the ones sulfonated in solution. The infection of HEK 293 cells with active and inactivated Vaccinia Virus IHD-W lead to a significantly up-regulation of the energy metabolism and the cellular gene expression. Interestingly thereby is that the effects of UV-inactivated viruses and infectious viruses on the hosts proteome are quite similar. In contrast the modulation of apoptosis is clearly affected by effects that correlate with infectious viruses. This result tends to the fact that the up-regulation of the energy metabolism and alterations in the regulation of the cellular gene expression are results of virus entry and virions proteins, but apoptosis modulation is controlled by newly expressed virus proteins. Finally the expression regulation of 24 human proteins by the viral infection was identified, whereby several of the regulated human proteins have not been described in conjunction with poxvirus infections in the literature yet and two of the identified proteins (ATPase family AAA domain containing 3A & 14 kDa cell fusion protein) are just predicted on transcription level or through sequence homology. Protein glycosylation as the major co- and post-translational modification affect in vivo safety and efficacy of therapeutic recombinant proteins, significantly showing high influence on functions, stability and biological compatibility. False glycosylation has influence resulting in a decrease of function or in allergic reaction. Glycosylation highly depend on the host cells and changes in glycosylation are a major cause of batch-to-batch variability and cultivation parameters. For these reasons, it is essential to investigate and control glycosylation especially if the protein is produced in non human cell lines. Therefore the glycosylation status of human Erythropoietin and human Interleukin-4 expressed in Sf21 insect cells by baculovirus infection was observed by hydrophilic interaction liquid chromatography and mass spectrometry and compared to human autologous glycosylation. Control of successful expression and identification of both protein constructs was done by Western Blotting and peptide fragment fingerprinting of their SPITC derivatized tryptic peptides and leads to sequence coverages up to 59 % and mascot protein scores of 154. MS based analysis of the N-glycosylation sites of rhuEPO and rhuIL-4 tryptic peptides results in a threefold glycosylation of rhuEPO at N 44, 58 and N 103 and a single glycosylation of rhuIL-4 at N 58 which is equivalent to human glycosylation. O-glycosylation analysis of rhuEPO leads to a mucin Type I O-glycan structure at S 146 which is despite of two missing sialic acids also human autologous. For the MS and HILIC analysis N glycans are released via PNGase F/A digestion, labeled with 2-AB fluorescence marker. MS spectra and HPLC chromatograms show a high percentage of undesired but insect typical paucimanosidic structures (M3, F(6)M3, M3A1 & F(6)M3A1). In addition some minor complex and even sialylated glycans could be detected. For rhuEPO the detected sialylated complex glycans are F(6)A2G(4)1S(6)1, A2G(4)1S(6)1, F(6)A2G(4)1 and for rhuIL 4 F(6)A3G(4)3S(6)3, A3G(4)3S(6)3, F(6)A3G(4)3S(6)2, A3G3S2, A3G(4)3S(6)1. A additional protein digestion with PNGase A show no difference and therefore no hyper allergic -(1,3)-fucosylation on both proteins. These results demonstrate the ability of Baculovirus Expression Systems for the generation of complex N-glycan structures in Sf21 cells. Some of the complex structures were detected in insect cells for the first time.

Abstract

Trotz der Ausrottung der humanen Pocken durch die WHO von 1967-1977 sind Pockenviren eine ernste gesundheitliche Gefahr. Die potentielle Bedrohung von Pockenviren als biologischer Kampfstoff als auch die Gefahr von zoonotischen Pockeninfektionen bei Menschen sind Gründe für Untersuchungen der Virus-Wirts-Interaktion. Die Permissivität einer Pockeninfektion ist unabhängig von Oberflächenrezeptoren der Wirtszelle und wird nur durch die Immunantwort der Wirtszelle beeinflusst. Daher wird vor diesem Hindergrund der Einfluss einer Pockeninfektion mit aktiven und UV-inaktivierten Vacciniaviren des Stammes IHD W auf das Proteom von HEK 293 Zellen mittels 2-D Gelelektrophorese und MALDI-ToF MS in einem top-down-Ansatz untersucht. Hierzu ist eine optimierte Festphasen-basierte Peptidderivatisierungsmethode mit 4 Sulfophenylisothiocyanat (SPITC) an ZipTipµ-C18 Säulen entwickelt worden, um eine hohe Proteinidentifikationsrate durch MS basierte Peptidsequenzierung zu gewährleisten. Das entwickelte Verfahren ermöglicht die Identifizierung der Peptidsequenzen anhand charakteristischer Serien von Y-Ionen und generiert im Vergleich zu bekannten Verfahren in Lösung 7 fach höhere Signalintensitäten und 4-fach höhere Signal/Rausch-Verhältnisse. Innerhalb der Proteome führt die Virusinfektion zu einer Expressionssteigerung von Proteinen, des Energiemetabolismus oder der DNA-Expression, wobei der Einfluss von UV-inaktiviertem und nativem Virus auf die Wirtszelle annähernd identisch ist. Zudem zeigen die Ergebnisse der Untersuchungen eine durch den aktiven Virus initiierte Modulation der Apoptosekaskade. Dies ermöglicht den Schluss, dass für die Zunahme des Energiestoffwechsels und die Veränderung der Proteinbiosynthese vorwiegend Proteine des Viruskapsids verantwortlich sind, welche bereits bei Penetration des Virus in die Zelle vorliegen. Die Modulation der Apoptose als Schutzmechanismus des Virus findet allerdings nur nach Infektion mit nativen Viren statt. Insgesamt ist der infektionsregulatorische Einfluss auf 24 humane Proteine nachgewiesen worden, wobei viele bisher nicht im Kontext einer Pockevireninfektion beschrieben worden sind und zwei Proteine (ATPase family AAA domain containing 3A & 14 kDa cell fusion protein), bisher lediglich auf Transkriptionsebene und durch Homologievergleiche bestätigt sind. Als wichtigste co- und posttranslationale Proteinmodifikation spielt die Glykosylierung eine entscheidende Rolle für die in vivo Aktivität und Verträglichkeit von Proteintherapeutika. Zudem beeinflusst sie die Funktion und Stabilität des entsprechenden Proteins und führt bei ungeeigneter Ausprägung zu Aktivitätsverlusten und allergischen Reaktionen. Die Glykosylierung wird primär durch das Expressionssystem determiniert aber auch Chargenvariationen und Kultivierungsparameter beeinflussen die Art des Glykanmusters. Aus diesem Grund ist die Glykosylierung ein wichtiger Qualitätsparameter, der vor allem bei rekombinanten Proteinen aus nicht humanen Zellsystemen kontrolliert werden muss. In dieser Forschungsarbeit wird das Glykosylierungsmuster von humanem Erythropoietin und humanem Interleukin-4 aus Sf21 Insektenzellen mittels hydrophiler Interaktionschromatographie und MALDI-ToF MS untersucht und mit dem human autologen Glykosylierungsmuster der beiden Proteine verglichen. Zur Überprüfung der erfolgreichen Expression und zur Identifizierung der beiden Proteinkonstrukte erfolgt ein spezifisches Western Blotting gegen die N-termiale His6-Sequenz, sowie ein post-source decay der SPITC-derivatisierten tryptischen Peptide der Konstrukte. Die massenspektrometrische Identifizierung führt zu einer Sequenzabdeckung von 59 % und mascot protein scores von bis zu 159. Die MS Analyse der N Glykosylierungsstellen liefert für rhuEPO eine dreifache Glykosylierung an allen drei Konsensussequenzen N 44, 58 und N 103 sowie für rhuIL-4 eine einfache Glykosylierung an N 58, was jeweils der humanen Glykosylierung entspricht. Die Bestimmung der O Glykosylierung von rhuEPO zeigt einen mucinen Typ I an S 146, der abgesehen von zwei fehlenden Sialinsäuren ebenfalls human autolog ist. Die kombinierte HILIC und MALDI-ToF MS Analyse der durch PNGase F/A abgespaltenen N-Glykane zeigt primär die für Insekten typischen pauci-mannosidischen-Strukturen M3, F(6)M3, M3A1 und F(6)M3A1. In deutlich geringerer Intensität sind auch komplexe sialysierte Strukturen detektierbar. Für rhuEPO können die komplexen N-Glykane F(6)A2G(4)1S(6)1, A2G(4)1S(6)1, F(6)A2G(4)1 und für rhuIL-4 F(6)A3G(4)3S(6)3, A3G(4)3S(6)3, F(6)A3G(4)3S(6)2, A3G3S2, A3G(4)3S(6)1 detektiert werden. Ein Verdau mit PNGase A zeigt keine neuen Strukturen, -(1,3)-Fucosylierung nicht nachgewiesenso dass keine hoch allergene ist. Die Ergebnisse zeigen das Potential des Baculoviren-Expressionssystem in Sf21 Zellen komplexe Glykanstrukturen zu produzieren. Einige der detektierten Strukturen sind erstmalig in Insekten nachgewiesen worden.

DOI
Document's Licence
Faculties & Collections
Zugehörige ORCIDs